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常用分子生物学技术的原理及其应用级临床医学.ppt
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1、常用分子生物学技术的原理及其应用级临床医学(二)聚合酶链式反应(二)聚合酶链式反应(PCR)PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中,PCR常与其它技术如分子杂交,限制酶酶谱分析,单链构象多态性检测,限制性片段长度多态性分析,DNA序列测定等联合应用。(三)单链构象多态性(三)单链构象多态性 单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,sscp)检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法,常与PCR联合应用,称为PCRSSCP技术。2020/11/42(四)限制酶酶谱分析(四)限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶位点
2、的丢失或其相对位置发生改变,以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA,通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。(五)(五)DNA序列测定序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法,可以确定突变的部位的突变的性质。(六)(六)DNA芯片技术芯片技术 应用DNA芯片,可以检测基因的结构及其突变多态性,对基因表达的情况进行分析。2020/11/43第一节分子杂交与印迹技术、探针技术分子杂交与印迹技术、探针技术2020/11/44一、分子杂交与印迹技术的原理2020/11/45在在DNA变变性性后后的的复复性性过过程程中中,如如果果将将不不同同种种类
3、类的的DNA单单链链分分子子或或RNA分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中,只只要要两两种种单单链链分分子子之之间间存存在在着着一一定定程程度度的的碱碱基基配配对对关关系系,在在适适宜宜的的条条件件(温温度度及及离离子子强强度度)下下,就就可可以以在在不不同同的的分分子子间间形形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。这这种种杂杂化化双双链链可可以以在在不不同同的的DNA与与DNA之之间间形形成成,也也可可以以在在DNA和和RNA分分子子间间或或者者RNA与与RNA分分子子间间形形成成。这这种种现现象象称称为为核核酸酸分子杂交分子杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridizati
4、on)2020/11/46(一)印迹技术将各种生物大分子从凝胶转移到一种固将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印迹技术定基质上的过程称为印迹技术(blottingblotting)。)。2020/11/47分子印迹分子印迹(渍渍)的概念的概念。将凝胶中的将凝胶中的DNADNA片段变性使其成为单链,然后片段变性使其成为单链,然后再将一张硝酸纤维素再将一张硝酸纤维素(nitrocellulose(nitrocellulose,NC)NC)膜放在凝胶上,上面放上吸水纸巾,利用毛细膜放在凝胶上,上面放上吸水纸巾,利用毛细管作用原理使管作用原理使DNADNA片段转移到片段转移到 NCNC
5、膜上,使之成膜上,使之成为固相化分子。载有为固相化分子。载有DNADNA单链分子的单链分子的 NCNC膜就可膜就可以在杂交液与另一种带有标记的以在杂交液与另一种带有标记的 DNADNA或或RNARNA分分子子(即探针即探针)进行杂交,具有互补序列的进行杂交,具有互补序列的RNARNA或或DNADNA结合到存在于结合到存在于 NCNC膜的膜的 DNADNA分子上,经放射分子上,经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。的区带。由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹,因此称为印迹技术。迹,因此称为印迹技
6、术。2020/11/48(二)探针技术2020/11/49 探针探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸多聚核苷酸,与固定在与固定在NC膜上的核苷酸结合,判断是否膜上的核苷酸结合,判断是否有同源的核酸分子存在。有同源的核酸分子存在。因此印迹技术与探针技术往往同时使用。2020/11/410 分子杂交、印迹技术、探针技术实验分子杂交、印迹技术、探针技术实验目目 录录2020/11/411二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用DNA印迹技术印迹技术(Southern blott
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