生物技术药物.doc
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1、生物技术药物总结第一讲总论 生物技术药物(Biotechdrugs or Biopharmaceuticals):指采用生物技术生产的用于疾病的预防、治疗和诊断的制品。 生物技术:指以现代生命科学为基础,结合其他基础科学的科学原理,采用先进的科学技术手段,按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人类生产出所需产品或达到某种目的。n 主要包括:基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、抗体工程。n 生物技术药物分类(按化学特性):天然生物技术药物;重组活性蛋白、多肽;基因药物(核酸药物)第二讲基因工程基本过程与方法(一)原核表达载体(大肠杆菌)功能元件:启动子及调控序列、核糖体结合位点
2、、松弛型复制子、转录终止区、多克隆位点、筛选标记哺乳动物细胞表达载体功能元件:原核DNA序列、启动子、终止子和多聚腺苷化信号、拼接信号、筛选标记第三讲基因工程基本过程与方法(二)基因文库的构建、基因工程中的常用酶、DNA测序 cDNA文库:指通过克隆的方法保存在宿主中的一群混合分子,这些分子中的插入片段的总和可代表某种生物全部mRNA序列。cDNA基因文库构建的步骤:细胞总RNA的提取和mRNA的分离;第一条cDNA合成:oligo(dT)引物引导的DNA合成法、随机引物合成法、特定寡核苷酸引物合成法;第二条cDNA合成:自身引物合成法、置换合成法、外加引物合成法双链cDNA克隆进质粒或噬菌体
3、载体并导入宿主中繁殖 限制性核酸内切酶(同尾酶):一类能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列并能切割DNA双链的核酸内切酶。识别序列特点:多数具有严格的识别序列;识别序列的长度:48个碱基对;序列特征:回文序列第四讲基因工程基本过程与方法(三)细胞转化与转染连接子导入受体细胞:转化:将质粒或DNA导入宿主细胞,引起细胞遗传的改变。转染:真核细胞的转化转导:通过噬菌体(或病毒)将宿主基因从一个细胞转移到另一个不同基因型的细胞中。常用方法:原核细胞:CaCl2感受态法、噬菌体体外包装法真核细胞:电穿孔法、DNA-磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法 CaCl2感受态法: 适用于革兰氏阴性细菌。
4、原理:是钙离子与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲(Heat Shock)发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,使DNA分子能够通过。优点:操作方便缺点:转化效率较低重组体克隆的筛选与鉴定:抗药性标记筛选、兰-白斑筛选(-互补)、 DNA电泳检测 -互补:将缺陷-半乳糖苷酶N端部分序列的质粒载体转入缺陷-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主菌,并且在含有X-gal的培养基上选择性培养,用乳糖类似物IPTG作为安慰性诱导剂进行诱导。质粒转入宿主菌后,宿主与质粒产生的有缺陷的-半乳糖苷酶之间可以形成互补,对X-gal进行降解可产生蓝色菌落,这就是-互补现象。定点突变:1、盒式诱变:利用一段人工合成的
5、具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。2、寡核苷酸引物诱变:指应用合成的寡核苷酸片段作为诱变剂,诱发基因或DNA片段中特定位点发生突变的技术。3、PCR诱变寡聚核苷酸介导的突变 盒式突变 PCR介导的突变 优点 保真度高 简单易行 突变效率高 操作简单 突变成功率高 缺点 突变效率相对低操作复杂 周期长受到酶切位点的限制 后续工作复杂 TaqDNA 聚合酶保真性偏低 第五讲原核表达系统 启动子(promotor):是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。 核糖体结合位点(RBS):遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合位点(RBS)。它是起始密码子AUG上游的
6、一段非翻译区序列。常用的启动子转录调控系统 1、 Plac转录调控系统:弱, IPTG诱导2、 l PL和l PR转录调控系统: 强,热诱导3、 Ptrp转录调控系统: 强,吲哚丙烯酸4、 Ptac转录调控系统:强,IPTG诱导 5、 PT7转录调控系统:转录活性高,特异性强;IPTG诱导表达形式:蛋白质结构:非融合型表达:天然完整蛋白 融合型表达:如GST融合表达蛋白融合型表达:如GST融合表达蛋白优点: 1、转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列调控,表达效率较高2、融合蛋白较天然真核蛋白更稳定3、可以利用识别原核肽段的配体进行亲和层析纯化4、融合蛋白分子量大,易于电泳鉴定表达部位:包涵体、
7、周质表达 包涵体:存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原因:目的基因的高表达,使蛋白无足够时间进行肽链折叠,产生凝集;种种原因引起的蛋白不能正确折叠;蛋白的性质;温度、pH值等环境条件的影响等。特点:1. 简化外源基因表达产物的分离操作:2. 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定周质分泌表达的特点 1、 分泌后的蛋白产物不含氨基端甲硫氨酸2、 原核生物细胞质中的还原环境不利于蛋白二硫键的形成,而氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境,便于新生肽链折叠成天然结构,从而获得完全生物活性的重组蛋白3、 一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白在周质中稳定性提高 第六讲 真核表
8、达系统真核表达载体的主要构件:1. 启动子和增强子、终止信号和poly(A)信号、剪接信号;2. 允许载体在细菌内扩增的序列:复制起始位点和抗药性标记基因;3. 多克隆位点:插入外源DNA片段4. 用于筛选出外源基因已整合的选择标记:a) 抗生素抗性基因,如:neo基因:使细胞产生对新霉素衍生物G418的抗性。 b) 营养缺陷型基因,如:二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因等等5. 显性活动调控区(dominant control region, DCR)序列,克服因载体整合在宿主基因组不同位点而产生的表达水平降低。酿酒酵母作为表达宿主的优缺点优点:1、安全无毒、不致病;2、遗传背景清楚,易进行遗
9、传操作;3、培养条件简单;4、易进行载体DNA的导入缺点:1、发酵时产生乙醇,乙醇的积累会影响酵母本身生长,较难进行高密度发酵2、蛋白质的分泌能力较差3、常发生过度糖基化毕赤酵母表达系统优缺点优点: (1)高表达:表达载体一般利用醇氧化酶基因(AOX1)的启动子,功能很强。(2)高分泌:应用啤酒酵母a因子的前导序列,有很好的分泌效果,有些蛋白分泌表达可10g/L;(3)高稳定:一般用整合型载体YIP,整合于染色体上,构建的转化子菌株十分稳定;(4)糖基化功能较啤酒酵母更接近高等真核生物。缺点: (1) 分子生物学研究基础差,对其进行遗传改造困难较大;(2) 发酵虽能达高密度,但发酵周期较长;(
10、3) 不是一种食品微生物,发酵时又要添加甲醇,因为AOX1启动子是被甲醇调控的,当毕赤酵母以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源时,菌体可以生长,但AOX1启动子是关闭的,当这些碳源耗尽,添加甲醇时,AOX1的mRNA可占总mRNA 5%。昆虫表达系统的优缺点优点:1、插入较大的外源基因,借助多元表达载体可以同时表达多个外源基因;2、表达载体一般使用多角体蛋白或p10等强启动子,实现蛋白的超高表达,可以达到细胞总蛋白的2550%; 3、能有效地进行蛋白质翻译的加工,如糖基化、脂酰化和磷酸化;4、杆状病毒有严格的宿主细胞专一性,对脊椎动物和植物即不能感染也不能在非宿主细胞中繁殖或发生整合,因此十分安全。缺点
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