![点击分享此内容可以赚币 分享](/master/images/share_but.png)
基因诊断和基因治疗(1)ppt课件.ppt
《基因诊断和基因治疗(1)ppt课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基因诊断和基因治疗(1)ppt课件.ppt(77页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、基因基因诊断和基因治断和基因治疗南通大学医学院生化教研室南通大学医学院生化教研室沈沈 勤勤1.概念:概念:基因基因是携是携带生物生物遗传信息的基本功能信息的基本功能单位,是位,是位于染色体上的一段特定位于染色体上的一段特定DNA序列。基因的改序列。基因的改变,会会导致各种表型的改致各种表型的改变,进而引起疾病的而引起疾病的发生。生。将基因或其将基因或其组成部分成部分发生异常的疾病生异常的疾病统称称为基因病基因病。2.基因病分基因病分为三大三大类:一、一、单基因病基因病:由由单个基因突个基因突变引起的一引起的一类疾病。疾病。如:血友病、地中海如:血友病、地中海贫血等。血等。二、二、多基因病多基因
2、病:由多个基因突:由多个基因突变综合作用引起的合作用引起的 疾病。如:疾病。如:恶性性肿瘤、高血瘤、高血压、动脉硬化、脉硬化、糖尿病、先天畸形等、糖尿病、先天畸形等、三、三、获得性基因病得性基因病:指外源基因(:指外源基因(DNA)侵入,)侵入,在机体在机体产生疾病,一旦将其清除便可痊愈。生疾病,一旦将其清除便可痊愈。如:艾滋病及各种微生物感染病。如:艾滋病及各种微生物感染病。3.第一第一节 基因基因诊断断 (DNA diagnosis)一、基因一、基因诊断的概念和基本概况断的概念和基本概况临床床诊断断生化学生化学诊断断免疫学免疫学诊断断临床疾病床疾病诊断四种方式:断四种方式:以疾病表型改以疾
3、病表型改变为依据。依据。(细胞形胞形态结构构变化、代化、代谢产物异常、特定蛋白分子物异常、特定蛋白分子识别差异等)差异等)基因基因诊断断对患者基因直接分析患者基因直接分析4.基因基因诊断定断定义(概念):(概念):基因基因诊断断是利用是利用现代分子生物学和分子代分子生物学和分子遗传学的技学的技术方法,直接方法,直接检测患者体内基因患者体内基因结构及构及其表达水平是否正常,从而其表达水平是否正常,从而对疾病作出疾病作出诊断或断或辅助助诊断。断。基因基因诊断是在断是在DNA/RNA水平水平检测分析基因的分析基因的存在、存在、结构构变异和表达状异和表达状态,与,与传统诊断方法断方法比比较有其特点:有
4、其特点:5.基因基因诊断的特点:断的特点:1、病因、病因诊断:断:直接瞄准病理基因,不直接瞄准病理基因,不仅对表型出表型出现的疾病作出的疾病作出诊断,断,还可能可能发现潜在的致病因素,如潜在的致病因素,如:确定有确定有遗传家族史的人携家族史的人携带致病基因。致病基因。2、特异性、特异性强、灵敏度高:、灵敏度高:选用特定基因序列作用特定基因序列作为探探针,单拷拷贝基因采用高度基因采用高度扩增增PCR技技术。3、稳定性高定性高4、诊断范断范围广,适广,适应性性强目的基因是否目的基因是否处于活化状于活化状态均可。均可。样品可品可长期保存。期保存。可可检测正在生正在生长的病原体或潜在病原体。的病原体或
5、潜在病原体。(与以疾病表型改(与以疾病表型改变为依据的依据的 诊断技断技术相比)相比)6.基因基因诊断的基本概况:断的基本概况:伴随分子生物学理伴随分子生物学理论技技术的的发展而建立和展而建立和发展。展。DNA双螺旋双螺旋 遗传密密码破破译 DNA重重组 癌基因与抑癌基因研究癌基因与抑癌基因研究 地中海地中海贫血病基因治血病基因治疗和逆和逆转录病毒病毒载体开体开发 PCR、分子、分子杂交等一系列技交等一系列技术发展展7.二、基因二、基因诊断的断的对象象1、病原生物的侵入、病原生物的侵入病原体:病毒、支原体、病原体:病毒、支原体、细菌、寄生虫菌、寄生虫检查诊断方法:断方法:显微微镜、免疫学方法、
6、基因、免疫学方法、基因诊断等。断等。尤其是当无抗体尤其是当无抗体时,基因,基因诊断成断成为唯一手段。唯一手段。2、先天、先天遗传性疾病性疾病遗传性疾病性疾病:发病的原因病的原因为特定基因的突特定基因的突变。8.肿瘤的瘤的发生:生:发病机理尚不病机理尚不请。初步初步认为是个是个别细胞基因突胞基因突变而引起的而引起的 细胞无限增殖胞无限增殖.(包括抑癌基因和癌基因)(包括抑癌基因和癌基因)3、后天基因突、后天基因突变引起的疾病引起的疾病二、基因二、基因诊断的断的对象象9.(1)用核心)用核心顺序的串序的串联重复序列重复序列组成探成探针进行行杂交研交研 究,可同究,可同时检出具有高度出具有高度多多态
7、性位点性位点。(2)用)用southern 杂交得到交得到DNA指指纹图谱个体个体识别、亲子子鉴定、法医物定、法医物证4、其他、其他二、基因二、基因诊断的断的对象象遗传稳定,个体特异,因而用于法医和定,个体特异,因而用于法医和亲子子鉴定。定。10.基因基因诊断的基本策略:断的基本策略:1、检测已知的能已知的能产生某种特定功能蛋白的基因生某种特定功能蛋白的基因 这些基因根据其特定功能已被克隆,并被定位些基因根据其特定功能已被克隆,并被定位在染色体上,基因序列亦被在染色体上,基因序列亦被测定,致病定,致病时的基因改的基因改变亦亦较清楚。清楚。如:已被克隆的病毒、如:已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生
8、虫的基因、菌、霉菌和寄生虫的基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、地中海地中海贫血、苯丙血、苯丙酮尿症等尿症等遗传病基因。病基因。11.2、检测与某种与某种遗传标志志连锁的致病基因的致病基因遗传连锁同一染色体相同一染色体相邻的二个或二个以上的基因的二个或二个以上的基因或限制性或限制性酶切位点,由于位置十分靠近,在切位点,由于位置十分靠近,在遗传时分离分离几率很低,常一起几率很低,常一起遗传-称称连锁。染色体染色体遗传连锁图用限制性内切用限制性内切酶酶切位点作切位点作遗传标志,定位与之相志,定位与之相连锁的正常基因与致病基因,建立相的正常基因与致病基因,建立相应的的遗
9、传连锁图谱。定位性克隆定位性克隆根据根据遗传连锁图进行定位性克隆。比行定位性克隆。比较正常正常和异常基因的差和异常基因的差别,可找出,可找出导致致遗传病的分子缺陷。病的分子缺陷。定位性克隆定位性克隆策略是当前基因策略是当前基因诊断的重要基断的重要基础。12.3、检测表型克隆基因表型克隆基因针对多基因病(如:重度肥胖、哮喘、高血多基因病(如:重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身免疫性疾病)。、精神病、多种自身免疫性疾病)。表型克隆技表型克隆技术是将有关表型与基因是将有关表型与基因结构构结合,直接合,直接分离分离该表型的相关基因,并表型的相关基因,并对疾病相关的疾病相关的一一组基因基因进
10、行行克隆,然后用作多种探克隆,然后用作多种探针,来,来诊断多基因断多基因遗传病。病。该策略既不需策略既不需预先知道基因的先知道基因的生化功能或生化功能或图谱定位,也不受定位,也不受基因数目及其相互作用方式的基因数目及其相互作用方式的影响。影响。方法:方法:1、DD-RT-PCR:分析正常和异常基因分析正常和异常基因组寻找两者之找两者之间的差异序列的差异序列2、基因、基因组错配配筛选技技术:寻找两者的全同序列,分找两者的全同序列,分离、离、鉴定与疾病相关的基因,确定定与疾病相关的基因,确定导致疾病的分子致疾病的分子缺陷缺陷13.基因基因诊断的基本步断的基本步骤:1、获得待得待检样品:提取核酸品:
11、提取核酸(PCR提高灵敏度提高灵敏度)2、制、制备和和标记核酸探核酸探针3、基因、基因检测分析分析 14.三、基因三、基因诊断的常用技断的常用技术l核酸分子核酸分子杂交交l聚合聚合酶链反反应(PCR)l限制性片段限制性片段长度多度多态性(性(RELP)l扩增片段增片段长度多度多态性(性(AFLP)l等位基因特异的寡核苷酸(等位基因特异的寡核苷酸(ASO)l单链构象多构象多态性(性(SSCP)l基因芯片基因芯片15.1、核酸分子、核酸分子杂交交原理:原理:利用核酸的利用核酸的变性、复性及碱基互性、复性及碱基互补的性的性质,用,用已知基因的核酸序列作已知基因的核酸序列作探探针,与,与变性后的性后的
12、单链基因基因组DNA/RNA杂交,交,检测核酸核酸样品中是否品中是否存在与探存在与探针互互补的同源核酸序列,的同源核酸序列,进行行DNA或或RNA定性定量分析。定性定量分析。基因基因检验的两个必要条件:的两个必要条件:1、必需的特异探、必需的特异探针(标记的的)2、必需的基因、必需的基因组DNA16.核酸分子核酸分子杂交核酸印迹交核酸印迹杂交交lDNA印迹印迹杂交(交(Southern blot)lRNA印迹印迹杂交交 (Nouthern blot)l斑点印迹斑点印迹杂交交 (Dot-blot)l原位原位杂交交 (situ hybridization)17.核酸印迹核酸印迹杂交基本交基本过程:
13、程:提取提取DNA或或RNA 酶切切 凝胶凝胶电泳泳 胶胶变 性性处理(理(DNA)转印核酸片段到印核酸片段到NC膜上。膜上。(RNA可直接用可直接用变性胶性胶电泳泳,转膜)膜)1、制、制备样品:品:18.核酸印迹核酸印迹杂交基本交基本过程:程:(2)制)制备探探针:探探针:一段能和待:一段能和待检测核酸分子按碱基互核酸分子按碱基互补配配对 原原则而而结合的核酸分子片段。合的核酸分子片段。探探针需要需要标记可直接可直接检测的元素或分子。的元素或分子。如:同位素、如:同位素、荧光、生物素等光、生物素等19.核酸印迹核酸印迹杂交基本交基本过程:程:核酸印迹核酸印迹杂交可交可检测pg水平的靶分子水平
14、的靶分子(4)检测:方法依方法依标记的探的探针而不同而不同 *放射性同位素放射性同位素 *生物素生物素 *地高辛地高辛 *荧光素光素(3)杂交:交:预杂交封交封闭非特异性非特异性结合位点合位点 杂交探交探针与核酸分子与核酸分子结合合20.核酸印迹核酸印迹杂交基本交基本过程:程:21.2、聚合、聚合酶链反反应(PCR)原理:原理:以待以待扩增增DNA为模板模板,在互,在互补模板两端序列的模板两端序列的寡核寡核苷酸引物苷酸引物介介导下,通下,通过耐高温耐高温DNA聚合聚合酶催化下,催化下,按半保留复制机制延模板按半保留复制机制延模板链延伸,快速、特异地延伸,快速、特异地扩增特定的增特定的DNA。一
15、种体外模一种体外模拟自然自然DNA复制复制过程的核酸程的核酸扩增技增技术。(无(无细胞分子克隆技胞分子克隆技术)。)。22.耐高温耐高温DNA聚合聚合酶Taq酶寡核苷酸引物:寡核苷酸引物:设计引物和确定退火温度是引物和确定退火温度是PCR 成功的关成功的关键。PCR的基本的基本过程:(循程:(循环程序)程序)变性(性(95)退火(退火(555565)延伸(延伸(72)35分分401分分100bp/1分分源自水栖高温菌,最适反源自水栖高温菌,最适反应温度温度为72,且,且经90以上加温后仍可在温度恢复后复性。以上加温后仍可在温度恢复后复性。23.(呈(呈2n 扩增速度)增速度)PCR基本过程和原
16、理特点:特异性特点:特异性强 灵敏度高灵敏度高样品可以是:品可以是:毛毛发、血痕、血痕 单细胞、胞、病原体、病原体、肿瘤残留物、瘤残留物、犯罪犯罪现场遗留物留物24.基因基因诊断中常用的断中常用的PCR技技术:(1)、)、DNA PCR:(2)、)、RT-PCR:以以DNA为模板,模板,扩增特定核苷酸序列。用于增特定核苷酸序列。用于检测特特定基因片段的存在,分析定基因片段的存在,分析鉴定基因突定基因突变。以以总RNA或或mRNA为模板,逆模板,逆转录为cDNA后后扩增。用增。用于于检测特定基因表达水平的主要方法之一。特定基因表达水平的主要方法之一。(3)、)、PCR-SSCP:检测基因未知突基
17、因未知突变的常用技的常用技术。简单、快捷、灵敏。、快捷、灵敏。25.(4)、多重)、多重 PCR:指在一次指在一次PCR反反应中加入多中加入多对引物,同引物,同时扩增增DNA序列上不同序列片段的一种序列上不同序列片段的一种PCR技技术。用于一些。用于一些“超大超大”基因中大片段缺失分析。基因中大片段缺失分析。(5)、原位)、原位 PCR:直接用直接用组织切片和切片和细胞胞进行行PCR或或RT-PCR,在,在组织、细胞原位胞原位检测单拷拷贝或低拷或低拷贝的特点基因序列。的特点基因序列。(6)、)、实时定量定量 PCR:借助特异性借助特异性结合合DNA的的荧光染料,光染料,实时动态检测PCR扩增的
18、增的DNA量的量的变化。化。26.其他重要的其他重要的PCR衍生技衍生技术反向反向PCR(IPCR)标记引物引物PCR(labelled primers PCR)锚定定PCR(anchored PCR)差异展示差异展示PCR(DD-PCR)(见书“分子生物学技分子生物学技术”章章节)27.3、限制性片段、限制性片段长度多度多态性(性(RFLP)检出方法:出方法:Southern 印迹印迹概念:概念:用同一限制性内切用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的基完全切割同一物种的不同个体的基因因组DNA,出,出现分子分子质量不同的同源片段,量不同的同源片段,这种由限种由限制性内切制性内切酶酶切
19、位点切位点变化化导致的致的DNA片段差异,称限片段差异,称限制性片段制性片段长度多度多态性(性(RFLP)。)。人人类基因基因组中由中由中性突中性突变导致个体致个体间核苷酸核苷酸的差异称的差异称DNA多多态性性28.RFLP类型:型:2、由于、由于链内内发生生较大片段的缺失、重复、插大片段的缺失、重复、插入和重入和重 排排导致致DNA顺序的序的变化,因而化,因而酶切片切片段改段改变 序列多序列多态性性。1、单个碱基的突个碱基的突变引起引起酶切位点的切位点的变化化 点多点多态性性致病基因附近或内部一般存在致病基因附近或内部一般存在RFLP,可用于可用于连锁分析的基因分析的基因诊断。断。29.(四
20、)(四)扩增片段增片段长度多度多态性(性(AFLP)应用于基因突用于基因突变性性质不明的不明的连锁分析。分析。AFLP串串联重复的短片段的重复的短片段的长度多度多态性性通通过PCR扩增增,经限制性内切限制性内切酶酶切后切后电泳泳,产生生显示示扩增片段多增片段多态性。性。30.AFLP原理:原理:首先利用可首先利用可产生生粘性末端粘性末端的限制性内切的限制性内切酶酶切研切研究究对象的基因象的基因组序列,序列,产生不同生不同长度的度的酶切片段。然切片段。然后,将后,将这些些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的切片段与含有与其有共同粘性末段的人人工接工接头连接接,形成,形成模板模板。为达到达到选择性性
21、扩增的目的,增的目的,再在模板末端添加具有再在模板末端添加具有选择性核苷酸(性核苷酸(13个)的不个)的不同引物同引物,然后,然后PCR扩增,增,结果只有那些两端序列与果只有那些两端序列与选择性核苷酸配性核苷酸配对的的酶切片段被切片段被扩增。最后将被增。最后将被扩增的增的片段在高分辨率的片段在高分辨率的测序凝胶上序凝胶上电泳,泳,这样其多其多态性即性即根据根据扩增片段的增片段的长度与数量的不同而被分开。度与数量的不同而被分开。PCR扩增增产物即等位片段之物即等位片段之间差差别只有几个只有几个bp。31.5、等位基因特异的寡核苷酸、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)方方法法:1、合成两种探、合成两
22、种探针:已知突已知突变位点的核苷酸序列(位点的核苷酸序列(M M)正常基因碱基序列(正常基因碱基序列(N N)2、杂交交实验结果:果:M+N-受受检者是突者是突变基因的基因的纯合子合子 M-N+受受检者是不存在突者是不存在突变基因基因M-N-受受检者的缺陷基因可能是一种新的突者的缺陷基因可能是一种新的突变类型型M+N+受受检者是突者是突变基因的基因的杂合子合子原理:原理:已知基因突已知基因突变部位和性部位和性质,合成基因特异的核苷酸探,合成基因特异的核苷酸探针(20bp),),标记后与受后与受检者者DNA杂交交诊断。(可与断。(可与PCR联用:用:PCR-ASO)32.6、单链构象多构象多态性
23、(性(SSCP)日本日本Orita等研究等研究发现,单链DNA片段呈复片段呈复杂的的空空间折叠构象,当有一个碱基折叠构象,当有一个碱基发生改生改变时,会或,会或多或多或 少地影响其空少地影响其空间构象,使构象构象,使构象发生改生改变,空空间构象有差异的构象有差异的单链DNA分子在聚丙分子在聚丙烯酰胺胺凝胶中受排阻大小不同凝胶中受排阻大小不同.因此,通因此,通过非非变性聚丙性聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳(PAGE),可以非常可以非常 敏敏锐地将构地将构象上有差异的分子分离开象上有差异的分子分离开.PCR-SSCP33.PCR-SSCP基本基本过程程PCR扩增靶增靶DNA将特异的将特异的PCR扩增增
24、产物物变性后快速复性性后快速复性;将将单 链DNA进行非行非变性聚丙性聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳;通通过放射性自放射性自显影、影、银染或溴化乙染或溴化乙锭显 色分色分析析结果果.若若发现单链DNA带迁移率与正常迁移率与正常对照照的相比的相比发生改生改变,就可以判定,就可以判定该链构象构象发生改生改变,进而推断而推断该DNA片段中有碱基突片段中有碱基突变.34.7、基因芯片、基因芯片 将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上,将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与然后与标记的的样品品进行行杂交,通交,通过检测根据根据杂交分子和未交分子和未杂交分子信号的交分子信号的强弱弱进而判断而判断样品中靶分子的
25、数量。品中靶分子的数量。基本原理:基本原理:(生物集成模片、(生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片)列、或寡核苷酸微芯片)35.基因芯片技基因芯片技术:36.目的:目的:检测外源性基因的侵入外源性基因的侵入目标:1 1、微生物、微生物2 2、病毒、病毒 如:如:HIVHIV(致艾滋病(致艾滋病 AIDSAIDS)3 3、寄生虫、寄生虫、4 4、不易体外培养的病原体(毒性大、不易体外培养的病原体(毒性大肠杆菌、麻杆菌、麻风分枝分枝 杆菌)杆菌)5 5、实验室培养的病原体(克立氏体)室培养的病原体(克立氏体)四、基因四、基因诊断的断的 临床床应用用:1、在感染性疾病、在感染性疾病检测中中应用
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基因 诊断 基因治疗 ppt 课件
![提示](https://www.zixin.com.cn/images/bang_tan.gif)
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【精***】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【精***】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。