基于生物信息学的胰腺导管腺癌核心风险基因筛选和分析_景晓莹.pdf

宁夏医科大学学报45卷胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是一种恶性程度极高并具有高度侵袭性的消化道恶性肿瘤。因其 5 年生存率不足7%，是恶性肿瘤中预后最差的1-2。PDAC 早期的症状隐匿、不典型3，约 80%的患者被确诊时为中晚期或出现转移，已错失最佳手术根治的窗口和机会。即使成功实施手术干预，术后 12 个月内的复发率和转移率仍高达 60%4。因此，准确有效的生物标记物筛选及其分子机制研究对于 PDAC的诊断、治疗和不良预后改善具有十分重要的临床意义和研究价值。加权基因共表达网络（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）已被广泛用于寻找各种癌症中的枢纽基因。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库中缺乏正常组织的 PDAC 样本，差异表达数据不完整。因此，本研究整合基因型-组织表达数据库（genotype-tissue expression，GTEx）数据库中正常对照组织的表达数据，有效地克服 TCGA 数据库对照样本不足的问题。通过差异表达分析，获得PDAC 原发癌全面的转录组表达谱，并使用 WGCNA、蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）网络分析结合表达生存分析，获得核心风险基因，以识别潜在准确的 PDAC 生物标记物。1材料与方法1.1数据获取与处理PDAC 组织的 RNA-seq 数据来自 TCGA，匹配的正常组织表达数据来自 GTEx5。过滤去除基因表达值低于 lcpm 剪切阈值 80%以上的样本，通过 filterByExpr 函数去除表达矩阵中不表达或低表达的基因。最后纳入共 312 个样本，包含147 例原发肿瘤组织，165 例正常组织（图 1）。1.2差异表达分析使用 edgeR 包筛选差异表达基因（differentialexpression genes，DEGs），以 log2（Fold Change）1且调整 P0.8 和 cor.gene Trait Significance0.2，从而识别和鉴定出模块基因。1.5PPI 的构建和核心基因筛选获得候选核心风险基因，利用 CytoscapeGene MINIA 插件，构建 PPI 网络和 MCODE 插件筛选网络核心基因。采用默认参数，聚类算法为MCC。1.6核心风险基因的功能分析使用 GEPIA2 在线数据库（http：/gepia2.cancer- PDAC 核心风险基因进行表达、生存分析，其生存分析主要包括生存率和风险比（hazard ratio，HR）。P0.05 为差异有统计学意义。1.7核心风险基因的临床诊断价值评价使用 SPSS 25.0 统计学软件绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线，并计算 ROC 曲线下的面积（area under curve，AUC），评估对肿瘤和正常组织的区分能力。2结果2.1DEGs 的筛选经选取上调和下调各 Top 50 的基因进行无监督垂直聚类分析，结果显示，DEGs 能够显著区分 PDAC 组织和正常组织（图 2A）。经差异表达分析，共筛选出 4 346 个 DEGs，其中包含 2 284个上调基因和 2 062 个下调基因（图 2B）。A.Top 100 DEGs 无监督聚类热图；B.全部 DEGs 火山图。图 2差异表达基因聚类热图和火山图AB250200150100500-Log（FDR）Log2 Fold Change-6-3036Up2284NoChange10738Down2062景晓莹，等.基于生物信息学的胰腺导管腺癌核心风险基因筛选和分析下载 TCGA+GTEx 表达数据库（Tumor=147，Normal=165）差异表达分析（获得 DEGs）GO 和 KEGG 富集分析WGCNA 分析核心基因的表达验证核心基因的生存趋势交叉选择模块基因PPI 网络（Cytoscape）选择核心特征基因259宁夏医科大学学报45卷2.2DEGs 的 GO 功能富集分析和 KEGG 通路分析为进一步分析 DEGs 的功能，将 DEGs 输入FunRich 进行 GO 和 KEGG 富集分析。DEGs 中BP 主要包括细胞外和质膜整体等（图 3A）；CC主要包括细胞通讯和细胞生长等（图 3B）；MF 主要包括细胞黏附分子活性和受体活性等（图3C）。KEGG 通路富集分析 PDAC 中的 DEGs 与间充质向上皮细胞转变（EMT）、上皮细胞向间充质转变（MET）和整合素细胞表面相互作用等信号通路密切相关（图 3D）。2.3WGCNA 的构建及分析通过绘制样本聚类树，设定剪切高度为 90，去除异常值（图 4A），进行样本聚类和表型关联分析（图 4B）。根据无尺度网络拟合指数和平均连接度计算软阈值（图 4C），根据基因模块连通性确定软阈值（图 4D），选取 =10（无标度 R2=0.8，斜率=-2.11）作为网络构建软阈值（图 4E），并根据 TOM 矩阵构建基因间的分层聚类树（图4F）。表型-模块关联分析结果显示，lightgreen 模块与 TNM 分期有相关性（r=0.33，P=0.02），magenta模块与肿瘤大小程度有相关性（r=0.3，P=0.03），grey 模块与组织学分级有相关性（r=0.34，P=0.02）（图 5A图 5C），且能够较好区分肿瘤组织和正常对照（图 5D）。进一步将 lightgreen、magenta 和grey 模块分别作为关键模块进行 GS 和 MM 分析，lightgreen 模块的 GS 与 MM 有相关关系（r=A.GO 生物过程富集上调的前 10 个条目；B.GO 细胞组成富集上调的前 10 个条目；C.GO 分子功能富集上调的前 10 个条目；D.前 10 个显著富集的 KEGG 通路。图 3DEGs 的 GO 和 KEGG 富集分析ABCD-log10（P-value）-log10（P-value）-log10（P-value）-log10（P-value）Percentage of genesPercentage of genesPercentage of genesPercentage of genesPercentage of genesP=0.05 referenceP-value024680123402468101214024681012140510152025051015200510152025303505101520253035Cell surfaceIntegrin complexProteinaceous extracellular matrixExosomesExtracellular matrixExtracellular regionExtracellular spaceIntegral to plasma membraneExtracellularPlasma membraneCatalytic activityCytoskeletal protein bindingMetallopeptidase activityReceptor bindingChemokine activityCell adhesion molecule activityMHC class II receptor activityMHC class I receptor activityReceptor activityExtracellular matrix structural constituentCell adhesionSpindle assemblyXenobiotic metabolismCell surface receptor linked signal transductionEnergy pathwaysMetabolismCell communicationSignal transductionCell growth and/or maintenanceImmune responseValidated transcriptional targets of AP1 family membersFra1 and Fra2Interferon gamma signalingEndosomal/Vacuolar pathwayLipid digestion，mobilization，and transportCell surface interactions at the vascular wallChemokine receptors bind chemokinesBeta5 beta6 beta7 and beta8 integrin cell surfaceinteractionsImmunoregulatory interactions between a lymphold and anon-lymphoid cellMesenchymal-to-epithelial transitionEpithelial-to-mesenchymal transition2.1%p=0.0350.5%p=0.0011.2%p0.00117.5%p0.001p0.001p0.001p0.001p0.001p0.001p0.0011.9%5.1%4.7%9.8%19%32.3%0.4%p=10%p=10.1%p=10.1%p=1p=1p=1p0.001p0.001p0.001p0.0019.9%10.2%23%24.3%8.7%5.5%3.3%p=0.3571.5%p=0.2390.5%p=0.2051.5%p=0.154p=0.086p=0.079p=0.025p=0.019p0.001p0.0012.1%1.4%0.8%1.7%6.7%6.2%3.9%p=0.0151.9%p=0.0021%p=0.0021.3%p=0.002p0.001p0.001p0.001p0.001p0.0010.7%2.9%0.6%0.6%3.5%2.1%p0.0012603期基因模块log2fcP 值调整后 P 值TOP2Agrey6.150.0010.001TPX2grey6.100.0010.001NUSAP1grey3.970.0010.001ARNTL2grey3.930.0010.001MAD2L1grey3.690.0010.001KIF23grey3.490.0010.001PLK1grey3.120.0010.001CENPUgrey3.090.0010.001RACGAP1grey3.040.0010.001CITgrey3.000.0010.001CKAP2grey2.890.0010.001TUBA1Cgrey2.770.0010.001SPAG5grey2.720.0010.001STILgrey2.570.0010.001HMGB2grey2.430.0010.001PRC1grey2.230.0010.001CDC6grey2.210.0010.001TYMSgrey2.190.0010.001CENPNgrey2.030.0010.001FEN1grey2.030.0010.001NCAPG2grey2.020.0010.001ATAD2grey1.920.0010.001PCNAgrey1.740.0010.001FGD6grey1.720.0010.001CBX3grey1.700.0010.001CCT5grey1.680.0010.001PRIM2grey1.610.0010.001THOC3grey1.550.0010.001C1orf112grey1.540.0010.001KNSTRNgrey1.540.0010.001SMC4grey1.520.0010.001PDCD10grey1.510.0010.001NFE2L3grey1.510.0010.001NDC1grey1.500.0010.001CHEK1grey1.500.0010.001ARHGAP11Agrey1.450.0010.001RRM1grey1.450.0010.001INCENPgrey1.440.0010.001FBXO45grey1.400.0010.001RCC1grey1.360.0010.001NCBP2grey1.230.0010.001ACTL6Agrey1.190.0010.001RHNO1lightgreen1.880.0010.001AP2B1lightgreen1.860.0010.001DERAlightgreen1.350.0010.001CCDC43lightgreen1.320.0010.001PCTPlightgreen1.230.0010.001PLAUmegenta4.990.0010.001PYGLmegenta2.320.0010.001PANX1megenta2.100.0010.0010.27，P0.001）（图 6A）；magenta 模块的 GS 与MM 有相关关系（r=0.39，P0.001）（图 6B）；grey模块的 GS 与 MM 有相关关系（r=0.54，P0.001）（图 6C）。对各颜色模块的连通性进行分析，发现lightgreen 模块的基因显著性与连通性有相关关系（r=0.33，P=0.001 3）；magenta 模块的基因显著性与连通性有相关关系（r=0.12，P=0.046）；grey模块的基因显著性与连通性有相关关系（r=-0.26，P=0.006 8）（图 6D）。最后，经过多重检验矫正后P0.8 和 cor.gene Trait Significance0.2 用于筛选模块中的核心基因。共获得 36 个候选基因，采用聚类分析方法和 MCC 算法，最后获得 22 个核心基 因（TOP2A、MAD2L1、TPX2、RACGAP1、PRC1、KIF23、NUSAP1、PLK1、SMC4、CHEK1、CENPU、CENPN、TYMS、FEN1、PCNA、CDC6、INCENP、ARHGAP11A、SPAG5、ATAD2、RRM1、NCAPG2）（图 7）。PPI 网络中颜色是 MCC 分析的度量值映射，圈的大小是 PPI 得分映射。A.通过样本聚类来检测离群值；B.去除离群值样本后的样本树状图及其特征热图；C.最佳软阈值拟合分析；D.不同软阈值的平均连通性分析；E.在=10 时检查无标度拓扑结构；F.基于不同相似性度量（1-TOM）的 PDAC 模块内的树状图和关系热图。图 4加权基因共表达网络的构建Sample Clustering to Detect Sample OutliersABCDEFHeight12010080604020SFTMF Value0.80.60.40.20.0Mean Connectivity5 0004 0003 0002 0001 000051015205101520dist（dataExpr3）Scale independenceMean ConnectivitySoft Threshold（power）Scale Free Plot（Pearson），sft=10scale R2=0.8，slope=-2.11Soft Threshold（power）Network_heatmap_plot，Random Selected Genes1.61.82.02.22.4log10（k）log10（p（k）-0.5-1.0-1.5-2.0-2.52623期2.5核心风险基因的表达和生存分析通过在线网站 GEIPA 搜寻 PPI 网络得分前10 个的核心风险基因在 PDAC 和正常组织中的表达趋势。结果显示，核心基因在 PDAC 样本中的表达量均高于正常对照组（P 均0.05）（图 8A图8J）。生存分析显示，TPX2（HR=2.2，P=0.000 26）、PRC1（HR=2，P=0.001 3）、KIF23（HR=1.9，P=0.002 9）、RACGAP1（HR=1.9，P=0.003 1）和 NUSAP1（HR=1.8，P=0.004 6）等核心基因高表达与 PDAC不良预后均相关（图 9A图 9J）。2.6核心风险基因的诊断价值10 个基因的 AUC 值（MAD2L：0.999、TPX2：0.998、TOP2A：0.997、RACGGAP1：0.995、KIF23：0.995、NUSAP1：0.995、PLK1：0.992、PRC1：0.989、SMC4：0.986、CHEK1：0.986）均0.5，表明核心风险基因对肿瘤和正常组织具有良好的区分和诊断能力（表 2）。3讨论PDAC 是一种病死率高、诊疗困难的消化道恶性肿瘤，预后极差。对于肿瘤发生潜在机制的研究可能是 PDAC 诊断、治疗和延长患者生存时间的关键。高通量测序技术的发展为其分子病理、临床诊断和靶向治疗提供了新的希望11。WGCNA 作为有效的基于表型-基因表达权重关联分析的方法，能够有效提取高维基因表达数据中有效的模块信息，已被广泛用于疾病相关基因的挖掘12。在本研究中，通过联合 GTEx 中正常组织数据，有效克服 TCGA 数据库中 PDAC 正常对照缺乏的问题，剔除异常和低表达样本，通过差异表达分析，最终获得了 PDAC 全面的转录组表达谱，为 PDAC 基因表达和功能研究提供了较好的数据集。经差异表达分析，本研究共筛选出 4 346 个DEGs，其中上调基因 2 284 个，下调基因 2 062A.PDAC 基因划分的层次聚类图；B.模块内的层次聚类树和关系热图；C.PDAC 模块特征基因与临床信息相关系数矩阵热图；D.PDAC 特征基因垂直聚类热图。图 5共表达模块与临床表型的相关性分析景晓莹，等.基于生物信息学的胰腺导管腺癌核心风险基因筛选和分析ABgene Dendrogram and Module ColorsHeight1.000.950.900.850.800.75Dynamic Tree Cut1.20.80.40.010.80.60.40.2010.50-0.5-1Module-trait relationshipsCDMEblueMEmidnightblueMEroyalblueMEgreenyellowMEredMEblackMEpurpleMEcyanMElightcyanMEgrey60MEgreenMEsalmonMElightgreenMEtanMEturquoiseMEmagentaMEyellowMElightyellowMEbrownMEpinkgender_classlymphnodeexaminedcounthistologicgrade_classTNMmaximumtumordimension263宁夏医科大学学报45卷个。对前 125 个上调和下调基因聚类分析显示，DEGs 可以显著区分 PDAC 组织和正常组织。通过富集分析，模块基因所涉及的 BP 主要包括细胞外、质膜整体和质膜；CC 主要包括细胞通讯、细胞生长和信号转导；MF 主要包括细胞黏附分子活性、受体活性和催化活性。利用 WGCNA 分析筛选了与 PDAC 组织学分级、肿瘤大小和 TNM分期密切相关的 grey 模块、magenta 模块和 lightgreen 模块，进一步区分共表达网络和 36 个 PPI网络候选基因。通过生物信息学分析鉴定出 10个核心基因，包括 TOP2A、MAD2L1、TPX2、RACGAP1、PRC1、KIF23、NUSAP1、PLK1、SMC4、CHEK1，最后经过 ROC 曲线的验证，与 PDAC 的进展和预后密切相关。这些核心基因的表达在 PDAC 和正常组织之间差异有统计学意义。同时，它们与PDAC 的组织学分级高度相关，可能是潜在的生物标记物。以上结果可能有助于改善 PDAC 患者的治疗决策、风险分层和预后预测。这 10 个核心基因通过对肿瘤细胞周期的调控，参与了肿瘤的发生和增殖。本研究中，筛选获A.greenyellow 模块中的模块成员；B.magenta 模块中的模块成员；C.grey 模块中的模块成员；D.各模块的连通性与基因之间的关系。图 6模块基因与临床表型聚类热图及各模块的连通性A.不同模块核心基因的韦恩图；B.蛋白质相互作用加权网络图。图 7PPI 构建和核心基因筛选ABDEGsgreymagentalightgreenADBCModule membership vs.gene significancer=0.27，P=5e-06Module membership vs.gene significancer=0.39，P=3.9e-13Module membership vs.gene significancer=0.54，P=1.1e-09Gene signifocamce forlymphnodeexaminedcountGene signifocamce for tumordimension0.40.30.20.10.00.40.30.20.10.00.40.30.20.1Gene signifocamce for histologicgradeModule Membership in greenyellow moduleModule Membership in magenta moduleModule Membership in grey60 module0.40.50.60.70.80.90.40.50.60.70.80.90.20.40.60.8ConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivityConnectivity010 20 30 40 500 1 2 3 4 5 6 70123450 51525350 1 2 3 4 5 6012345010 20 30 400510 15 20 2502040600.01.02.03.00.01.02.03.0012340.00.40.80 1 2 3 4 5 60.00.51.01.50.01.02.00246810024680.01.02.03.00 5 102030Gene significance0.40.20.0Gene significance0.40.20.0Gene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significance0.40.20.00.40.20.0Gene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significanceGene significance0.40.20.00.40.20.00.20.00.20.00.40.20.00.200.100.000.200.100.000.200.100.000.200.100.000.300.150.000.300.150.000.300.150.000.300.150.000.300.150.000.300.150.000.300.150.00brown r=0.41，P=9.6e-34green r=0.083，P=0.043grey60 r=-0.26，P=0.0068turquoise r=0.14，P=3.5e-09tan r=-0.12，P=0.14blue r=0.036，P=0.14pink r=0.13，P=0.027black r=0.014，P=0.79red r=-0.042，P=0.41lightgreen r=0.33，P=0.0013purple r=-0.057，P=0.41greenyellow r=-0.031，P=0.65cyan r=-0.02，P=0.83midnightblue r=0.45，P=1e-06salmon r=-0.13，P=0.14yellow r=0.27，P=3.1e-12lightyellow r=-0.091，P=0.4magenta r=0.12，P=0.046lightcyan r=-0.07，P=0.47royalblue r=-0.064，P=0.562643期A.TOP2A；B.MAD2L1；C.TPX2；D.RACGAP1；E.PRC1；F.KIF23；G.NUSAP1；H.PLK1；I.SMC4；J.CHEK1；n（PDAC，red）=179，n（Normal，grey）=171；*P 0.05。图 8前 10 个核心基因在肿瘤组织和非肿瘤组织中差异表达的箱线图A.TOP2A；B.MAD2L1；C.TPX2；D.RACGAP1；E.PRC1；F.KIF23；G.NUSAP1；H.PLK1；I.SMC4；J.CHEK1；红线表示核心基因的高表达；蓝线表示低表达。图 9前 10 个核心基因的生存分析曲线ABCDEFGHIJOverall SurvivalOverall SurvivalOverall SurvivalOverall SurvivalOverall SurvivalOverall SurvivalOverall SurvivalOverall SurvivalOverall SurvivalOverall Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival1.00.80.60.40.20.0Percent Survival020406080Months020406080Months020406080Months020406080Months020406080Months020406080Months020406080Months020406080Months020406080Months020406080Months景晓莹，等.基于生物信息学的胰腺导管腺癌核心风险基因筛选和分析ABCDEFGHIJExpression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）Expression-log2（TPM+1）654321054321065432105432105432105432105432107654321054321043210PDAC NormalTOP2APDAC NormalMAD2L1PDAC NormalTPX2PDAC NormalRACGAP1PDAC NormalPRC1PDAC NormalKIF23PDAC NormalNUSAP1PDAC NormalPLK1PDAC NormalSMC4PDAC NormalCHEK1*265宁夏医科大学学报45卷表 2基于不同核心风险基因预测 PDAC 的 ROC 分析基因AUC95%CIP 值MAD2L10.9990.9961.0000.001TPX20.9980.9961.0000.001TOP2A0.9970.9931.0000.001RACGAP10.9950.9871.0000.001KIF230.9950.9891.0000.001NUSAP10.9950.9891.0000.001PLK10.9920.9801.0000.001PRC10.9890.9781.0000.001SMC40.9860.9691.0000.001CHEK10.9860.9751.0000.001得的 NUSAP1、PRC1 和 SMC4 基因在PDAC 中研究相对较少。其中，NUSAP1 是一种在多种生物学功能中起着关键作用的微管相关蛋白，包括纺锤体组装、染色体分离、胞质分裂、微管交联、捆绑和附着在染色体上13。研究14表明，NUSAP1 参与了多种人类恶性肿瘤的生物学行为调控，如胰腺癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、前列腺癌、胃癌等。PRC1 是有丝分裂早期 CDK1（Cdc2/细胞周期蛋白 B）磷酸化的细胞质分裂所必需的微管相关蛋白。PRC1 被敲除的细胞通常经历间期、前期和中期；但纺锤体中心区域的结构在后期出现异常，导致细胞因子的异常表达和双核或多核细胞的形成15，从而促进肿瘤的发生和进展16。PRC1的过表达可通过调节 Wnt 信号通路的致癌作用，导致早期复发和患者的不良预后。PRC1 的下调也被证明可以显著抑制胃癌细胞的增殖，减少单层集落的形成，并抑制胃癌细胞的侵袭性和转移16。PRC1 在 PDAC 中异常表达，并显著富集于 EMT过程中，提示 PRC1 基因可能通过 Wnt 信号通路参与 PDAC 的 EMT 过程，但需要进一步实验研究证明。SMC4 是细胞分裂中的凝缩蛋白，参与细胞分裂过程中的染色体凝集、姐妹染色单体的凝聚、DNA 修复和复制17。SMC4 可通过激活宫颈癌中的 NF-B 通路促进宫颈癌的发生18。在侵袭性乳腺癌细胞中，SMC4 的 mRNA 表达上调。上调的 mRNA 可以提高 CDK1 在进入有丝分裂时驱动染色质压缩的敏感性，增强癌细胞的侵袭性、增殖活性和去分化能力18。SMC4 的高表达可能通过增强 TOP2A 的作用而增加双链 DNA 断裂，并导致乳腺上皮细胞中的突变、错配和独特的染色体重排19。过表达 SMC4 可激活 JAK2/Stat3和 TGF/Smad 通路，促进癌细胞的侵袭性20。SMC4 与 PDAC 的发病机制密切相关，其高表达导致 PDAC 的预后差17，21。综上所述，本研究经过不同生物信息学分析方法，发现 grey 模块与 PDAC 组织学分级高度相关，结合表达和生存分析，从模块中筛选出了TPX2、PRC1、KIF23、RACGAP1、NUSAP1、PLK1、SMC4、MAD2L1、TOP2A、CHEK1 等核 心风险基因。以上基因中，部分已在 PDAC 相关研究中报道，而大部分基因在 PDAC 中作用机制尚无明确报道。通过注释发现，核心风险基因可能通过调控细胞周期、DNA 复制、EMT 等生物学过程参与PDAC 的发病和预后，但上述基因的功能需要进一步实验证实。总之，本研究通过系统的基因差异表达和 WGCNA 分析，进一步结合生存分析和ROC 曲线的验证，发现了一系列重要的 PDAC 核心风险基因，为 PDAC 未来的临床诊疗与更好的预后干预提供了潜在的分子理论基础。参考文献：1 Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2020J.CA Cancer J Clin，2020，70（1）：7-30.2 Mizrahi JD，Surana R，Valle JW，et al.Pancreatic cancerJ.Lancet（London，England），2020，395（10242）：2008-2020.3 Buha A，Wallace D，Matovic V，et al.Cadmium exposure as a putative risk factor for the development ofpancreatic cancer：Three different lines of evidenceJ.Biomed Res Int，2017，2017（1）：1981837.4La torre M，Nigri G，Cavallini M，et al.The glasgowprognostic score as a predictor of survival in patientswith potentially resectable pancreatic adenocarcinomaJ.Ann Surg Oncol，2012，19（9）：2917-2923.5 Chen HM，Macdonald JA.Network analysis of TCGAand GTEx gene expression datasets for identificationof trait-associated biomarkers in human cancerJ.2663期Star Protocols，2022，3（1）：101168.6 Harris MA，Clark J，Ireland A，et al.The Gene Ontology（GO）database and informatics 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