人类Kras基因突变检测试剂盒新版说明书.docx
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1、人类K-ras基因突变检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)说明书【产品名称】通用名:人类K-ras基因突变检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)英文名:DiagnostickitforMutationsofHumanK-rasGene(PCR-MeltingCurveAnalysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因在12号染色体短臂上,是关键癌基因之一,编码一个21kDkras蛋白,参与细胞内信号传输,关键包含PI3K/PTEN/AKT和RAF/MEK/ERK信号转导路径,这些转导路径是目前肿瘤靶向药品研究热点,靶向药品经过抑制这些路径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发
2、生突变,将造成kras蛋白变异并处于连续激活状态,使药品失效。据中国肿瘤学临床实践指南,在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者回顾性研究中,全部患者均接收厄洛替尼单药一线诊疗。K-ras突变者无一例缓解(0/18),而无K-ras突变者则有20例缓解(20/62,32%),差异有统计学意义(P0.01)。所以,指南提议,非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药品前应进行K-ras基因突变状态检测。本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取基因组DNA为检测样本,用于检测肿瘤组织K-ras基因第12,13密码子12种体细胞突变(表1),提供突变状态定性结果。为临床肿瘤靶向药品个体化用
3、药提供辅助诊疗依据,本品适适用于进入个体化靶向诊疗疗程前患者使用。【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台,结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术,定性检测DNA样品中K-ras基因12,13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物,该引物可扩增12种突变型和野生型K-ras目标序列,利用标识了FAM荧光基团和淬灭基团双标识探针首先抑制野生型基因扩增,提升突变基因检测灵敏度,其次在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物分析,荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互靠近而被淬灭,不发荧光,杂交状态时,二者相互离开而产生荧光。该荧光探针分别和突变基因和野生型基因杂交产物在熔解曲线分析时,表现为熔
4、解曲线导数图中出现不一样位置峰,熔解峰对应位置即为熔解温度(Tm值),因野生峰位置较突变峰位置大3以上而得到区分,但多种突变峰因Tm值相差较小而不能分辨。本品可稳定地检出野生型10ng/ul基因组背景下1%含量体细胞突变,其熔解曲线会出现双峰,其中突变峰较野生峰Tm值显著降低(图1)。【关键组成成份】本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液和野生型对照品等3管试剂。PCR反应液I包含对应K-ras基因突变检测引物和探针,探针由FAM荧光指示;PCR反应液含有dNTP、Taq酶和MgCl2等。检测必需但试剂盒中不包含组分:1.5ml离心管(用于配制PCR反应液和DNA提取);0.2mlPCR管或
5、8联PCR管或96孔PCR板;带滤塞吸头(1ml、200l和10l);DNA提取试剂盒ReliaPrepFFPEgDNAMiniprepSystem(货号:A2352)【贮存条件及使用期】置于-20条件下储存,使用期6个月。4-10避光条件下储存或运输不得超出7天。【适用仪器】适适用于ABI7500、LinegeneFQD-96A型号Real-timePCR扩增仪。【样本要求】1.适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织切片,切片厚度10m,数量1片,所用切片样品保留不超出3年。2.因为肿瘤复杂性,所采集临床样品往往会混有正常组织细胞,石蜡包埋病理切片样品肿瘤病变细胞应不低于%,所取部
6、分应尽可能在蜡块中部;3.使用商业化试剂盒来提取人类基因组DNA,推荐使用Promega企业ReliaPrepFFPEgDNAMiniprepSystem(A2352)提取石蜡包埋组织切片样品,所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度,其DNAOD260/OD280值应在1.82.0,浓度应在3300ng/l之间,样本DNA质量不合格者不得用于检测,提议重新取切片进行核酸提取,提取完DNA提议立即进行检测,不然请于-20以下保留,保留时间不要超出6个月。【检验方法】一、核酸提取(样本处理室)使用ReliaPrepFFPEgDNAMiniprepSystem进行核酸提取,提取步骤以下。1.用矿
7、物油去除石蜡加矿物油500l到装有组织切片样本1.5ml离心管内,80孵育1min,振荡混匀;2.组织样本裂解,消化组织蛋白质1) 离心管内加入200l裂解液,室温10,000g离心15s,形成水油两相溶液,下层为水相,上层为油相;2) 向离心管水相加入20l蛋白酶K,用移液枪吸打混匀;3)56孵育1h;4)80孵育1h;5)冷却到室温,离心15s;3.去除RNA向离心管水相加入10lRNaseA,吸打混匀。室温(20-25)孵育5min;4.用核酸提取柱提取基因组DNA1)加入220lBLBuffer到含裂解样品离心管中,再加入240l乙醇(95-100%),震荡混匀,室温10,000g离心
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