呼吸道感染IgM九项联检试剂新版说明书终稿.doc
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1、呼吸道感染IgM九项联检试剂盒(间接免疫荧光法)说明书【产品名称】通用名称:呼吸道感染IgM九项联检试剂盒(间接免疫荧光法)英文名称:PNEUMOSLIDE IgM商品名称:PNEUMOSLIDE IgM 【包装规格】10人份/盒【预期用途】采取间接免疫荧光法(IFA),同时检测人血清中呼吸道感染关键病原体IgM抗体,可检病原体包含:嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型。已报道非经典性肺炎病原体有很多,其中最常见有:嗜肺军团菌人最易感染是嗜肺军团菌血清1型,非经典性肺炎常伴随有全身症状。10%肺炎是
2、由嗜肺军团菌血清1型引发。在血清学诊疗中, 间接免疫荧光法(IFA)是唯一标准技术。肺炎支原体肺炎支原体引发肺炎在儿童和青少年中最为常见,因为极难将其固定在载玻片上,所以先将肺炎支原体抗原固定在细胞中。Q热立克次体Q热是由Q热立克次体引发全身疾病,会造成发烧、非经典性肺炎、肝炎或心内膜炎。血清学诊疗中,IFA检测是最灵敏和最具指示性血清学诊疗方法。肺炎衣原体肺炎衣原体极易造成呼吸系统感染,尤其是支气管炎和肺炎。在老年人中发病率较高,它所引发肺炎占全部肺炎病例10%。微量免疫荧光法(MIF)是最灵敏和最特异诊疗方法。腺病毒腺病毒是一个关键呼吸道病原体,能引发上呼吸道疾病,伴随有急骤发烧和轻度呼吸
3、道感染。呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒(RSV)是两岁以下幼儿呼吸道感染关键病原体,在冬季爆发流行。流感病毒它是流感病原体,在含有潜在病理学患者中会产生严重并发症。因为它易于和其它呼吸道疾病混淆,所以在流行期临床诊疗很困难。所以,试验室诊疗就显得很关键。副流感病毒副流感病毒1、2和3型在2-4岁儿童中能引发喉气管支气管炎(哮吼)。3型含有流行性,1和2型含有地域性。【检测原理】间接免疫荧光法(IFA)是基于待测样本中抗体和吸附在载玻片上抗原发生反应。样本中存在特异性抗体和抗原反应,未和抗原结合免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中,抗原-抗体复合物和荧光素标识抗人球蛋白反应。用免疫荧光显微镜观
4、察结果。【关键组成成份】除PBS外,全部试剂均可直接使用。为了易于识别,全部试剂全部有一个给定编号。在操作骤中,写明了每一步所使用试剂编号。1 载玻片:10片(10孔/片),含有下列抗原:1. 嗜肺军团菌血清1型(悬浮于0.5%正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细菌聚集)2. McCoy细胞中肺炎支原体3. Q热立克次体II期(悬浮于0.5%正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细菌聚集)4. 肺炎衣原体(原生小体)5. HEp-2细胞中腺病毒6. HEp-2细胞中呼吸道合胞病毒7. LLC-MK2细胞中甲型流感病毒8. LLC-MK2细胞中乙型流感病毒9. LLC-MK2细胞中副流感病毒1、
5、2和3型10. 质控孔。除了嗜肺军团菌,载玻片中全部抗原全部是从细胞培养物中取得。每一个病毒孔里全部含有1%15%用甲醛灭活感染细胞,无感染细胞用丙酮固定。2 PBS:1瓶,pH 7.2PBS粉末,用1L蒸馏水溶解。3 阳性质控:500 L阳性质控血清,含叠氮钠。4 阴性质控:500 L阴性质控血清,含叠氮钠。5M FITC标识抗人IgM结合物:2 x 1.1mL,荧光素标识抗人IgM磷酸缓冲液,含有伊文斯蓝、叠氮钠和蛋白稳定剂。6 封闭介质 :3mL,甘油缓冲液,含叠氮钠。7 抗人IgG球蛋白(吸附剂):1 x 1.5mL(羊抗人IgG,含叠氮钠)。需要但未提供材料:1. 正确微量移液器2.
6、 恒温培养箱3. 蒸馏水4. 24x60 mm盖玻片5. 湿盒6. 荧光显微镜和制造商推荐滤光片【储存要求及使用期】28储存。不要使用超出标签上使用期试剂。未拆封试剂盒28储存可稳定至标示使用期月末。拆封后试剂储存试剂稳定性和储存溶解后PBS2-8C 4个月,在使用期内使用其它组分参考包装标签使用期(2-8C储存)试剂稳定性及操作在无菌条件下操作试剂以防微生物污染。仅使用试验所需量吸附剂、PBS、质控血清和结合物溶液,剩下试剂不要倒回瓶中。PBS溶解后储存在28 C,如出现浑浊请勿使用。对于试剂盒内试剂不正确操作,VIRCELL, S.L.将不对其试验结果负责。【适用仪器】 荧光显微镜【注意事
7、项】1. 仅用于体外诊疗。仅限专业人员使用。2. 仅使用试剂盒内组分,不要混用不一样试剂盒或不一样厂家试剂组分。只有PBS、吸附剂、封闭介质和载玻片可和其它批次VIRCELL IFA试剂盒通用,其它组分同批次能够混用。3. 每步操作必需使用洁净吸头,仅使用洁净耗材,最好是一次性使用耗材。4. 包装如有损坏请勿使用。5. 切勿用嘴吸移液管加样。6. 本试剂盒中吸附剂、结合物和质控血清含有动物源性物质,质控血清还含有些人源性物质。尽管本试剂盒中人血清质控品已经测试为HBsAg、HCV抗体和HIV抗体阴性,质控血清和病人样本仍应作为潜在感染性物质进行处理。孔内包被经灭活嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体
8、、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型,也仍应视为含有潜在感染性并小心处理。现在没有方法能够确保这些或其它感染性物质不存在,所以全部材料应视为含有潜在感染性进行处理,应遵守当地相关临床废弃物处理法规。7. 结合物、吸附剂、封闭介质和质控品含有叠氮钠(浓度0.1%),避免接触酸和重金属。8. 封闭介质含有甘油,请勿接触酸和暴露在高温下。9. 伊文斯蓝(浓度0.1%)是一个致癌物。请勿接触皮肤和眼睛。万一接触到该溶液,用水根本冲洗并到医院检验。10. 仅按本说明书进行操作,不遵守要求温育时间和温度会造成错误结果。11. 载玻片上病人样
9、本交叉污染会造成错误结果,要小心操作预防发生。12. 显微镜光学系统、光源条件和类型会影响荧光质量。13. 不要将试剂无须要地放置在室温下过长时间。14. 每个载玻片只能使用一次。不要分割,也不要再使用没有用过孔。15. 试剂盒里玻璃组分破碎时可能伤及身体,小心处理。16. 吸附剂加入样本后要注意观察是否有显著沉淀出现。【样本要求】需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。使用消毒或无菌技术能保持样本完整性。血清样本采集后28 C冷藏,如7天内不检测,则应冷冻(-20C)保留。不要反复冻融以预防免疫球蛋白滴度降低,尤其是IgM。不要使用高血脂或污染血清。若样本中含有微粒要离心使之澄清。【检测方法】*试
10、验前准备只有PBS需要预先配制。将试剂2 中成份加入1L蒸馏水中,摇匀直止完全溶解。配好后储存在2-8C。*试验步骤1. 使用前,将全部试剂平衡至室温。载玻片平衡至室温后再打开。2. 按1:1百分比稀释血清标本,即25L血清加入25L PBS2中。质控血清3 4不需要稀释。3. 用抗人IgG吸附剂7 处理稀释后血清:将30L稀释后血清加入150L吸附剂中,根本混匀。质控血清3 和4 不需吸附剂处理。处理后血清要离心除去沉淀,以防干扰检测。4. 在载玻片1 每孔中加15L吸附剂处理过血清。在一个载玻片每孔中加入15L不稀释阳性质控3,在另一个载玻片每孔中加入15L不稀释阴性质控4。5. 将载玻片
11、放入湿盒中,37温育90分钟。6. 用PBS 2 缓慢水流简单冲洗载玻片1(避免PBS直接冲入孔内)后,浸泡在PBS中并放置在振荡器上轻轻摇动10分钟。将载玻片在蒸馏水中简单蘸洗。7. 载玻片1 自然风干。8. 每孔加入15L抗人IgM FITC结合物溶液5M(不需稀释)。9. 将载玻片放入湿盒,37温育30分钟。10. 反复6和7洗涤步骤。11. 每孔加1小滴封闭介质6,小心盖上盖玻片。12. 立即用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。假如不能立即观察,可将其避光放置于2-8C不超出二十四小时。【内部质量控制】每一批产品在放行前全部要经过愈加严格内部质量控制(Q.C.)检验。质控材料可溯源
12、到经过内部确定参考血清盘。【有效性判定】每一次试验全部应设置阳性和阴性质控,以确定试验和试剂盒有效性。观察到荧光模式应为:阳性质控:腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控1-15%细胞出现苹果绿细胞核和胞浆或胞膜荧光(在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色合胞);军团菌、衣原体或立克次体中全部细菌展现出苹果绿荧光;支原体对阳性质控在细胞外围展现苹果绿色荧光。阴性质控:军团菌、肺炎衣原体和立克次体没有荧光,支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒细胞展现红色。【检测结果解释】阳性结果:能够观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清1
13、-15%细胞细胞核和胞浆出现苹果绿色荧光(在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色合胞);军团菌、衣原体或立克次体中全部细菌展现出苹果绿色荧光;支原体对阳性血清在细胞外围展现苹果绿色荧光。阴性结果:可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体没有荧光,支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒细胞展现红色。假如全部细胞或第10孔出现荧光表明存在抗核或抗细胞抗体,不能判为阳性,应用其它方法进行检测。当质控孔中无荧光时一定要查明原因。因为非军团菌感染病人中常常出现交叉抗体,阳性结果需结合临床症状综合评价。提议做较高稀释度检测来提升阳性估计值。呼吸道感染IgG联检试剂(PNEUMO
14、SLIDE IgG)更适合于筛查试验。对于广泛流行疾病,可能会在一个标本中出现多个阳性结果。呼吸道感染IgM联检试剂(PNEUMOSLIDE IgM)因为其高度特异性,是一个很适用技术,因为IgM阳性不会超出3个月,但对反复感染灵敏度较低。近期感染诊疗理想方法是同时使用呼吸道感染IgG联检试剂和呼吸道感染IgM联检试剂:IgM联检试剂适适用于检测成人第一个标本和儿童第一、第二个标本,IgG联检试剂适适用于检测成人第二个标本。和说明书中所列结果不一样不能判为阳性。在首次感染和再次感染过程中,IgG和IgM抗体有不一样表现方法:首次感染时,几乎在全部情况下IgM和IgG均出现(IgM早于IgG出现
15、);而再次感染时,在全部情况下均不出现IgM,所以IgG检测是唯一有用诊疗方法。在很多疾病中病人一生全部可能存在高滴度IgG,而IgM通常情况下仅在感染后23个月存在于血清中,所以是近期感染一个有效标志物。【检验方法不足】1. 本试剂盒用于检测人血清。2. 提议用户仔细阅读和理讲解明书,严格根据程序进行操作才能取得可靠检测结果。尤其是样本和试剂正确吸收和仔细洗板、温育时间控制对取得正确结果全部是很关键。3. 样本检测结果应和临床评价和其它诊疗方法结合使用。4. 本检测不能指出感染部位,不能单独使用。5. 抗体水平无显著上升时不能排除感染可能性。6. 在感染早期采集样本可能是检测不到IgG,在这
16、种情况下提议采取IgM检测,或在14-21天后采集第二个血清样本,并和原标本同时检测来确定是否发生血清转换。7. 婴儿IgG检测结果要作谨慎解释,因为出生前母体IgG被动传输给了胎儿。对6个月以下婴儿IgM检测是更为有用感染标志物。8. 单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染诊疗。应采集成对样本(急性期和康复期)同时检测来观察血清转化或抗体水平显著升高。9. 对患有本身免疫性疾病病人血清,用IFA检测时,支原体、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒,会在细胞上发生非特异性反应,这些血清不能用本方法评价。质控孔用于检测这种现象。在嗜肺军团菌和Q热立克次体中,有时血清会含有和卵抗原反应抗
17、体,所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。当出现这种情况时,该血清就不能用IFA进行分析了。10. 未对本检测在疗效随访方面性能做过评定。11. 除了肺炎外,未对本技术在肺炎衣原体引发其它疾病方面性能作过评定。【产品性能指标】1. 灵敏度和特异性嗜肺军团菌血清1型和另一个商品化IFA试剂盒对照检测82份血清样本,结果以下:样本数灵敏度特异性IgM 8294.4%98.4%有非特异性反应血清从最终计算中删除。肺炎支原体和一个ELISA试剂盒对照检测62份血清样本,结果以下:样本数灵敏度特异性IgM 6296.8%100.0%有非特异性反应血清从最终计算中删除。Q热立克次体和另一个商品化IFA
18、试剂盒对照检测74份血清样本,结果以下:样本数灵敏度特异性IgM 74100.0%97.6%有非特异性反应血清从最终计算中删除。肺炎衣原体和另一个商品化IFA试剂盒对照检测61份血清样本,结果以下:样本数灵敏度特异性IgM 61100.0%980%有非特异性反应血清从最终计算中删除。腺病毒和一个ELISA试剂盒对照检测74份血清样本,结果以下:样本数灵敏度特异性IgM 7485.7%97.0%有非特异性反应血清从最终计算中删除。呼吸道合胞病毒和一个ELISA试剂盒对照检测97份血清样本,结果以下:样本数灵敏度特异性IgM 9793.8%100.0%有非特异性反应血清从最终计算中删除。甲型流感病
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