一株真菌产生的强抗癌活性新的山酮类化合物及其作用机制的研究应用.doc
《一株真菌产生的强抗癌活性新的山酮类化合物及其作用机制的研究应用.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一株真菌产生的强抗癌活性新的山酮类化合物及其作用机制的研究应用.doc(12页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、一株真菌产生强抗癌活性新山酮类化合物及其作用机制研究路新华,郑智慧,可爱兵,马瑛,范玉玲,朱京童,林洁,李业英,崔晓兰,张华,贺建功(华北制药集团新药研究开发公司,微生物药物国家研究工程中心,石家庄050015 )目:发现新抗肿瘤先导化合物,并对其进行进一步抗癌机制研究。办法:运用MTT抗肿瘤细胞增殖筛选办法从微生物次生代谢产物中筛选具备抗肿瘤化合物,运用各种色谱手段分离活性化合物,通过化合物理化性质及波谱数据分析进行构造鉴定;并运用细胞形态、流式细胞仪、caspase 3/7活性在细胞周期、凋亡诱导效应、凋亡诱导机制等方面对其进行了抗肿瘤机制研究。成果:从一株真菌F02Z-1593固体发酵产
2、物得到5个山酮类化合物F02Z-1593 I、J、T、U和V,其中1593 I、T、U分别鉴定为Austocystin D、H、F, 1593 J和V为新化合物;5个化合物均体现出较好体外抗肿瘤和抑制血管内皮细胞增殖活性,并且对正常细胞人胚肝细胞体现出较低细胞毒作用。新化合物1593 J将肿瘤细胞周期阻滞在G1期,并引起细胞明显变圆、皱缩和核固缩等凋亡现象。1593 J能剂量和时间依赖地增长细胞中caspase 3/7活性。结论:分离得到两个新F02Z-1593J和V和三个已知山酮类化合物,该类化合物通过caspase 3/7途径诱导肿瘤细胞和血管内皮细胞凋亡起抗癌作用。核心词:Austocy
3、stin;细胞凋亡;山酮;caspaseABSTRACT Objective:To discover new anticancer compounds and study their active mechanism. Methods:Screening anticancer compounds from microbial metabolites by measuring the antiproliferation effects on MCF-7 cell line by MTT method. The active compounds were isolated and purified
4、 by various chromatographic techniques and their structures were elucidated based on analysis of physicochemical properties and spectroscopic data. Results:Five active xanthones named F02Z-1593 I,J,T,U,V were isolated from the solid fermentate of fungus F02-1593. F02Z-1593 I,T,U were identified as k
5、nown compounds Austocystin D,H and F respectively and F02Z-1593 J and V were two novel ones. All of the five compounds showed strong inhibitory activity against human cancer cell lines and vascular endothelial cell ECV304,while had low toxity to normal human embryo hepatocyte L02 in vitro. F02Z-1593
6、 J could arrest the cell cycle at phase G1,and induce the activities of caspase 3/7 in human cancer cells in dose and time dependent manner. Conclusion:Five anticancer xanthones were obtained . Among them two were novel and the other three were known. They play anticancer effect by induction apoptos
7、is of tumor and vascular endothelial cell lines through activation of caspase 3/7 pathway.KEY WORDS:Xanthones;Austocystin;anticancer;caspase;apoptosis癌症是人类最严重致死性疾病之一。在国内,癌症已长期居于病死因素之首。进入新世纪以来,这一危险趋势不但没有得到有效遏制,反而随着人类接触到致病因素不断增多而日益严重。寻找高效抗癌新化合物、新构造、新作用靶点始终是国际新药研发热点。本研究运用体外肿瘤细胞增殖抑制筛选办法,从一株真菌F02Z-1593发酵
8、产物中分离得到5个山酮类化合物F02Z-1593I、J、T、U和V,其中F02Z-1593J和V为新构造化合物。本文就这5个化合物分离、纯化、构造解析,其抗肿瘤活性以及其抗肿瘤诱导凋亡机制进行了阐述。1 材料与办法1.1 筛选用微生物菌株真菌菌株由本研究室从云南、四川和广西采集土壤中分离得到。筛选用样品为这些菌株发酵产物。1.2 试剂及仪器 RPMI-1640,培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(购于华美生物工程公司)。肿瘤细胞株HT29、MCF、MDA-MB-231、Hela,人胚肝细胞L02以及人脐静脉内皮细胞ECV304均购自于美国ATCC,均在含10%小牛血清RPMI-1640、5%CO2饱和
9、湿度、37条件下培养,并保存于本室。Caspase-3/7四肽荧光底物Ac-DEVD-AMC和Hochest3328购自于sigma公司色谱试剂购自Merck公司;Victor 1420多标计数仪(PE);中压层析系统(BUCHI);高效液相系统(Waters 5152+ PDA);液相色谱柱: Phenomenex C18 21.2250mm,10m;核磁共振仪 500MHz(Inova,Varian)质谱仪(Micromass,Waters);流式细胞仪(BECKMAN COULTER,USA)。1.3 真菌F02Z-1593培养将菌株F02Z-1593斜面接种于种子培养基(淀粉2%,葡萄
10、糖1%,黄豆饼粉0.2%,麦芽粉0.6%,酵母0.5%,CaCO3 0.2%,MgSO47H2O0.1,NaCl 0.2%,pH7.0),27,220rp,摇瓶培养3天。按1%接种量接种到固体培养基 (大米97.5%,黄豆饼粉2.5%) 27培养14天。1.4 F02Z-1593提取分离F02ZA-1593固体培养物2 kg,用4L乙酸乙酯萃取,减压蒸去溶剂得到红褐色油状物9g。上述粗提物经硅胶柱(2.650cm)色谱,氯仿-甲醇梯度洗脱,每50 ml收集一管,合并活性组分,减压蒸干。各某些活性物质使用Sephadex LH-20凝胶柱色谱(Pharmcia,1650mm ) 进一步分离纯化,
11、制备型HPLC进行单组分制备流动相为CH3CN-(1CF3COOH)H2O(3070%), 流速为16ml/min,得到化合物F02-1593I、J、T、U、V。1.5 细胞增殖抑制活性测定将培养瓶中培养好肿瘤细胞株胰酶消化、计数,以每孔约为1-2104 细胞数铺板,并加入不同稀释浓度测试样品,5% CO2、37条件下孵育72 h后,运用MTT法进行细胞增殖抑制活性测定。细胞增殖抑制率按如下公式计算:细胞增殖抑制率=(1-实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)100%。IC50为细胞增殖抑制50%样品浓度。1.6化合物对肿瘤细胞细胞及细胞核形态变化影响以每孔约为1-2104 细胞数铺板,并加
12、入不同稀释浓度测试样品,培养1天后,在电镜下观测细胞形态变化并拍照;细胞与样品共孵育培养一定期间后,运用4%甲醛固定20分钟,然后并用1g/mlHochest 33258荧光染色剂进行细胞核染色15分种。荧光显微镜下观测并拍照记录。1.7 流式细胞对细胞周期和凋亡分析 不同药物浓度或药物不同解决时间后收集细胞(15)106个,5001000r/min离心5min,弃去培养液。3ml PBS洗一次。离心去PBS,加入冰预冷70乙醇固定,4,1h。离心弃去固定液,3ml PBS重悬5min。用1ml (含5mg/ml PI,0.1% RNase A)PI染液,4避光30min。上流式细胞仪进行细胞
13、周期和凋亡分析检测。1.8细胞中caspase 3/7活性影响测定样品解决3天后,收集细胞,并用PBS洗涤一次,加入细胞裂解液,保温15min后加caspase-3/7四肽荧光底物Ac-DEVD-AMC,37C反映2h。分析荧光强度(激发光波长355nm,发射光波长为460nm)。依照释放荧光强度大小,测定caspase-3/7活性。2 成果2.1 F02Z-1593 I、J、T、U、V理化性质及构造鉴定F02Z-1593 I、J、T、U、V均为淡黄色粉末或细小针晶,易溶于氯仿和二甲基亚砜,溶于甲醇、丙酮, UV(MeCN)光谱显示它们吸取相似,均在225,254,325nm附近有三个吸取峰,
14、推测它们为同类物质。ESI-MS给出F02Z-1593 I、T、U质核比分别为413.2,395.2,327.2M+H+,依照MS、1H、13CNMR数据分析结合数据库检索拟定它们分别与Austocystin D1 2、H1 2、F3相似,化学构造见Figure 1。图1 F02Z-1593 I,J,T,U and V化学构造Figure 1 Chemical structures of F02Z-1593 I,J,T,U and VF02Z-1593 J:ESI-MS成果显示F02Z-1593 J 分子量比F02Z-1593 I 大16,13C NMR显示它们具备相似碳原子个数,并且除63.
15、7碳信号代替了23.5碳信号外,其他13C NMR数据基本相似,推测两个化合物具备相似母核,区别仅是在侧链上多一羟基。依照HMQC拟定了侧链上碳与氢连接,HMBC中连氧碳上氢与C5,6,10a有关阐明侧链连在C-5上,羟基连在C1”上,依照H-H COSY中H-1”与H-2”有关以及HMBC中H-2”与C-1”,3”,4”,5”,5有关拟定了侧链连接顺序,最后拟定了F02Z-1593 I化学构造(见Figure 1)。通过2D NMR数据分析并与F02Z-1593 I核磁数据比较对化合物F02Z-1593 J1H、13CNMR数据进行了全归属,成果见Table 1。F02Z-1593 V:ES
16、I-MS给出F02Z-1593 Vm/e为359.1M-H-,同位素峰是m+2且高度达到分子离子峰1/3左右,阐明分子中具有氯原子,与F02Z-1593 U 相比较,分子量多34,推测F02Z-1593 U分子中其中一种H被Cl取代。1HNMR中, 除化合物U 中三个相邻H变成了V中两个相邻H;13C-NMR中,除7,8位碳位移值变化较大外(111.1和160.4分别变化为115.1,156.2),1H 、13C-NMR其他数据与F02Z-1593U基本相似,因而拟定化合物F02Z-1593 V 为氯代Austocystin F。氯原子取代位置依照HMBC有关关系拟定,HMBC谱显示8-OHH
17、与季C7有有关,与苯环上两个连HC没有浮现明显有关信号;H6与C8有有关,H5与C10a有关但与C8无有关,由此断定Cl原子取代位置在8-OH邻位C7上,至此拟定了F02Z-1593V化学构造(见Figure 1)并对其1H、13CNMR数据进行了全归属(见Table 1)。经Scifinder数据库检索没有发现与F02Z-1593 J和V构造相似化合物,因而拟定该两个化合物为新化合物,分别命名为Austocystin K 和Austocystin L。表1. 化合物F02Z-1593 J 和 V1H (500MHz)和13C (125MHz)数据归属表Table 1. 13C (125MHz
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 真菌 产生 抗癌 活性 酮类 化合物 及其 作用 机制 研究 应用
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【精***】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【精***】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。