红树林沉积物中可培养细菌的分离及其系统进化分析_刘敏.pdf
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1、第 30 卷第 2 期2023 年 4 月海南热带海洋学院学报Journal of Hainan Tropical Ocean UniversityVol 30 No 2Apr 2023收稿日期:2022 12 07基金项目:海南热带海洋学院引进人才科研启动项目(RHDRC201901);海南省大学生创新创业训练项目(S202111100018;S202211100050);海南热带海洋学院研究生创新科研项目(RHDYC-202229)第一作者:刘敏,女,山东青州人,副研究员,博士,研究方向为海洋生态。红树林沉积物中可培养细菌的分离及其系统进化分析刘敏,甘禧霖,黄小峰,王洋,吴昊,孙睿(海南热
2、带海洋学院 生态环境学院,海南 三亚 572022)摘要:红树林沉积物蕴含着丰富的微生物资源,其中红树林细菌具有重要的开发利用价值。为了解红树林细菌资源多样性及其分布,采用稀释涂布培养法对三亚市青梅港红树林湿地保护区沉积物中可培养细菌进行分离和系统进化分析,共分离得到 47 株菌株,分属于 4 门 7 纲 16 目 18 科 29 属沉积物。在门水平上,主要包括变形菌门(Proteobacteria)(51 06%)、厚壁菌门(Firmicutes)(21 27%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(19 14%)和放线菌门(Actinobacteria)(8 51%)。丰度前 10 的
3、属主要有弧形菌属 Vibrio(12 77%)、Salipiger(10 64%)、Novosphingobium(6 38%)、Qipengyuania(6 38%)、微杆菌属 Microbacterium(4 26%)、Rossellomorea(4 26%)、微泡菌属 Microbulb-ifer(4 26%)、Muricauda(4 26%)、芽孢杆菌属 Bacillus(4 26%)及不动杆菌属 Acinetobacter(2 13%)。通过16S rDNA序列分析发现,有 5 株细菌的 16S rDNA 序列与其模式菌株的最大相似性在 96 00%97 00%之间,它们是潜在的新种
4、资源。以上结果表明,三亚市青梅港红树林沉积物中可培养细菌多样性较为丰富。关键词:青梅港;红树林;沉积物可培养细菌;16S rDNA中图分类号:Q178 53;S718 45文献标识码:A文章编号:2096 3122(2023)02 0025 07DOI:10 13307/j issn 2096 3122 2023 02 040引言红树林是世界上生产力最高的生态系统之一,具有净化海水、防风消浪、促淤保滩、固岸护堤等作用1。由于遭受海水的周期性浸淹,红树林沉积物呈现出高盐度、强还原性和强酸性等特点,这种特殊环境决定了红树林沉积物蕴藏着丰富且独特的微生物资源2。研究表明,与海岸、河口、河流等沉积物相
5、比,红树林沉积物的微生物多样性较高3,而且沉积物新种资源丰富4 6。例如,孙超等7 从红树林沉积物中分离出 Lachnotalea sp MCCC 1A16036 等 4 株疑似新属菌株;吴秋蕾8 从月亮湾红树林沉积物分离出 7 个潜在新种;Qian 等9 从东寨港红树林分离出 Pontibacillus sp HN14 菌株,并发现其中间代谢物具有降解苯并芘的活性;Bai 等10 从一种海洋红树林内生真菌青霉属(Penicillium sp JY246)中分离出四种具有开发新生物农药潜力的衍生物;Feng 等11 从红树林 Phomopsis asparagi DHS-48 中分离出一种新的
6、细胞松弛素,可以作为一种非细胞毒性的有效免疫抑制剂。红树林细菌在农业12 14、医药15 17、工业18 等多方面具有巨大的应用潜力。发现新菌株是开发细菌活性物质的重要途径19。红树林生态系统具有高生产力、高归还率和高分解率的“三高”特点,其微生物发挥着重要作用20。由于红树林沉积物中细菌物种资源丰富及其生态系统作用的重要性,因此,红树林成为寻找新菌株的热点生境。本研究利用传统培养方法对海南省三亚市青梅港红树林沉积物中的细菌进行分离培养、分子鉴定和系统发育分析,为进一步了解红树林细菌资源多样性及其分布提供基础数据,也为后续红树林细菌资源的开发利用提供菌种保障。52第 30 卷第 2 期海南热带
7、海洋学院学报1 材料与方法1 1 材料1 1 1 样品采集样品采集地点位于海南省三亚市亚龙湾青梅港红树林保护区,选取潮上带(1 个站位)和潮间带(2 个站位)共3 个站位,每个站位间隔2 km。在每个站位采用五点采样法21,每个采样点间隔200 m,每个采样点采集0 5 cm 深的沉积物样品各3 份,每份样品约50 g。将各个采样点的3 份重复沉积物样品放入无菌采样袋中混合均匀,置于冰盒储存,及时带回实验室。菌株分离时将 3 个站位的所有样品(45 份)混合均匀。1 1 2 培养基选用选用 5 种不同培养基对细菌菌株进行分离培养,5 种培养基分别为 ASB 培养基、DRN 培养基、NRS 培养
8、基、WA 培养基和 1%ALG+2216E 培养基。ASB 培养基(gL1):甘露醇 10,磷酸二氢钾 0 2,硫酸镁0 2,氯化钠 0 2,硫酸钙 0 1,碳酸钙 5,琼脂 18。DRN 培养基(gL1):蔗糖 10,苹果酸 5,磷酸氢二钾0 4,硫酸镁 0 2,氯化钙 0 02,钼酸钠 0 002,氯化铁 0 01,琼脂 18。NRS 培养基(gL1):50%红树林沉积物浸提液 1,琼脂 18。WA 培养基(gL1):琼脂 18。1%ALG+2216E 培养基(gL1):海藻酸钠 10,蛋白胨 5,酵母浸粉 1,柠檬酸铁0 1,氯化钠19 45,氯化镁5 98,硫酸钠3 24,氯化钙1 8
9、,氯化钾0 55,碳酸钠0 16,溴化钾0 08,氯化锶0 034,硼酸0 022,硅酸钠0 004,氟化钠0 002 4,硝酸钠0 0016,磷酸氢二钠 0 037,琼脂 18,以上培养基均用陈海水配制。1 2 方法1 2 1 细菌的分离纯化及保藏采用稀释平板分离法对沉积物样品进行细菌分离培养。针对不同的培养基,沉积物样品的前处理方式不同。利用 ASB 培养基和 DRN 培养基分离细菌前,沉积物样品处理有两种方式,分为80 处理20 min和常规处理。利用 NRS 培养基和 WA 培养基分离细菌前,沉积物样品经 120 处理 60 min。利用 1%ALG+2216E 培养基分离细菌前,沉积
10、物样品经 80 处理 20 min。沉积物样品经前处理后,称取 10 g 沉积物,放入盛有 90 mL 无菌海水的三角瓶中,经涡旋振荡器振荡混匀后,置于28、200 rmin1的恒温摇床中振荡 30 min。然后用灭菌超纯水将其充分稀释,稀释梯度为 101、102、103,每个梯度设置 3 个重复组,分别吸取 100 L 悬液,涂布于不同的分离培养基上,倒置于 28 恒温培养箱中培养观察。根据菌落形状、颜色、透明度、边缘样式、表面干湿状态等表型特征,挑取单菌落在上述 5 种选择性培养基上划线纯化5 8次,直至获得纯化培养。纯化后的细菌菌株分别置于 4 和 80 保存。1 2 2 16S rDN
11、A 序列测定及其系统发育分析参照文献 22 提取细菌菌株的基因组 DNA。利用引物 P1(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACG-CT-3)与 P6(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3)扩增 16S rDNA 基因。PCR 反应程序为:95 15 min;94 1 min,58 1 min,72 2 min,共30 个循环;72 10 min。将 PCR 产物送至上海生工生物工程有限公司进行16S rDNA 测序。将所得序列在 EzTaxon server 2 1 和 GenBank 中进行 BLAST 比对分析。采用 MEGA 7 0 以邻
12、位相连法(Neighbor-joining)构建系统发育树。2 结果与分析2 1 红树林沉积物细菌的分离从 5 种培养基上共分离获得可培养细菌 47 株,其中从 ASB 培养基分离得到的 22 株(包括经 80 水浴 20 min 处理后分离获得的 20 株),占分离总数的 46 81%。从 DRN 培养基分离得到的 22 株(包括经80 水浴 20 min 处理后分离获得的 9 株),占46 81%。从 NRS 培养基(经120 水浴60 min 处理)分离得到的 1 株,占 2 13%。从 WA 培养基(经 120 水浴 60 min 处理)分离得到的 1 株,占 2 13%。从 1%62
13、刘敏等:红树林沉积物中可培养细菌的分离及其系统进化分析2023 年第 2 期ALG+2216E 培养基(经 80 水浴 20 min 处理)分离得到的 1 株,占 2 13%。在 ASB 培养基和 DRN 培养基上生长的菌株种类较多,形态丰富多样,而 NRS 培养基、WA 培养基及 1%ALG+2216E 培养基上的菌株数量较少,丰富度较低。2 2 可培养细菌 16S rDNA 序列的测定将纯化菌株与数据库中的模式菌株做 16S rDNA 对比分析,47 株菌株分属于 4 门 7 纲 16 目 18 科 29属。4 个门分别为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicut
14、es)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)图 1(a),其中前 10 的属包括弧形菌属 Vibrio(12 77%)、Salipiger(10 64%)、Novosphin-gobium(6 38%)、Qipengyuania(6 38%)、微杆菌属 Microbacterium(4 26%)、Rossellomorea(4 26%)、微泡菌属 Microbulbifer(4 26%)、Muricauda(4 26%)、芽孢杆菌属 Bacillus(4 26%)及不动杆菌属 Acinetobacter(2 13%)图 1(b)。结果显示,青梅港红树
15、林保护区可培养细菌资源主要分布在芽孢杆菌科(Bacillace-ae,占 19 14%)和红杆菌科(Rhodobacteraceae,占 17 02%)。在 Bacillaceae 科中,共发现有 9 株菌分布在碱卤芽孢杆菌属 Alkalihalobacillus、盐芽孢杆菌属 Halobacillus、Priestia、Rossellomorea、芽孢杆菌属 Bacillus、Falsibacillus 和 Fredinandcohnia 7 个属中;在 Rhodobacteraceae 科中,共发现有 8 株菌分布在 Donghicola、Salipiger、Kangsaoukella 和
16、 Thioclava 4 个属中。此外,红杆菌科(Vibrionaceae)下有 Vibrio(6 株,12 77%),为可培养细菌的优势属,Rhodobacteraceae 科下有 Salipiger(5 株,10 64%),为次优势属。以上数据表明,在亚龙湾青梅港红树林保护区沉积物中细菌多样性最高的科为 Bacillaceae 科,其次是 Rhodobacteraceae科;丰度最高的属为 Vibrio(12 77%),其次是 Salipiger(10 64%)。(a)门水平(b)属水平图 1青梅港红树林沉积物中可培养细菌群落组成经菌株序列比对分析表明,16S rDNA 最大同源性为 10
17、0%的有 9 株;同源性在 99 00%99 90%有24 株;同源性在 97 00%98 90%有9 株;同源性低于97 00%的有5 株。其中,菌株 QMM10 与其模式菌株 Frondibacter aureus A5Q-67(T)、QMM32 与 Sinomicrobium oceani SCSIO 03483(T)、QMM33 与 Mucilagini-bacter limnophilus YBJ-36(T)、QMM46 与 Kangsaoukella pontilimi GH1-50(T)、QMM47 与 Paenibacillus nanen-sis MX2-3(T)的相似性,分
18、别为96 11%、96 00%、96 04%、96 36%、96 25%(表1),表明这5 株菌为红树林可培养细菌的潜在新种资源,有待进一步的多相分类鉴定。72第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报表 1青梅港红树林沉积物海洋细菌的 16S rDNA 序列分析菌株名称序列接收号最相似模式菌相似性/%QMM6ON386201Vibrio azureus NBRC 104587(T)99 78QMM7ON386202Vibrio variabilis R-40492(T)97 87QMM14ON386209Vibrio parahaemolyticus NBRC 12711(T)99 85QM
19、M17ON386212Vibrio plantisponsor MSSRF60(T)98 28QMM19ON386214Vibrio alginolyticus NBRC 15630(T)99 64QMM42ON386236Vibrio fluvialis NBRC 103150(T)100 00QMM13ON386208Salipiger pacificus DSM 26894(T)99 07QMM21ON386216Salipiger thiooxidans DSM 10146(T)100 00QMM25ON386220Salipiger pacificus DSM 26894(T)100
20、 00QMM36ON386230Salipiger pacificus DSM 26894(T)100 00QMM43ON386237Salipiger pacificus DSM 26894(T)99 69QMM1ON386196Novosphingobium arvoryzae Jyi-02(T)97 78QMM44ON386238Novosphingobium mathurense SM117(T)97 18QMM45ON386239Novosphingobium mathurense SM117(T)97 18QMM5ON386200Qipengyuania nanhaisedimin
21、is CGMCC 1 7715(T)99 01QMM16ON386211Qipengyuania nanhaisediminis CGMCC 1 7715(T)98 62QMM8ON386203Microbacterium thalassium IFO 16060(T)99 78QMM34ON386228Qipengyuania flava SW-46(T)99 15QMM27ON386222Microbacterium thalassium IFO 16060(T)99 85QMM9ON386204Rossellomorea vietnamensis 15-1(T)99 48QMM37ON3
22、86231Rossellomorea vietnamensis 15-1(T)99 33QMM20ON386215Microbulbifer taiwanensis CC-LN1-12(T)99 19QMM26ON386221Microbulbifer elongatus DSM 6810(T)98 89QMM28ON386223Muricauda beolgyonensis KCTC 23501(T)99 18QMM38ON386232Muricauda amoyensis GCL-11(T)99 55QMM29ON386224Bacillus cereus ATCC 14579(T)100
23、 00QMM35ON386229Bacillus tequilensis KCTC 13622(T)99 93QMM3ON386198Donghicola mangrovi B5-SW-15(T)100 00QMM4ON386199Pseudomonas aestusnigri VGXO14(T)99 70QMM10ON386205Frondibacter aureus A5Q-67(T)96 11QMM11ON386206Algoriphagus zhangzhouensis CGMCC 1 11027(T)99 85QMM12ON386207Pseudoalteromonas profun
24、di TP162(T)100 00QMM15ON386210Priestia megaterium NBRC 15308(T)100 00QMM18ON386213Halobacillus salinus HSL-3(T)99 93QMM22ON386217Aeromonas caviae CECT 838(T)99 63QMM24ON386219Isoptericola jiangsuensis DSM 21863(T)99 78QMM31ON386225Fredinandcohnia humi LMG 22167(T)98 54QMM32ON386226Sinomicrobium ocea
25、ni SCSIO 03483(T)96 00QMM33ON386227Mucilaginibacter limnophilus YBJ-36(T)96 0482刘敏等:红树林沉积物中可培养细菌的分离及其系统进化分析2023 年第 2 期表 1(续)菌株名称序列接收号最相似模式菌相似性/%QMM39ON386233Thioclava pacifica DSM 10166(T)98 14QMM40ON386234Demequina globuliformis NBRC 106266(T)99 40QMM41ON386235Acinetobacter venetianus RAG-1(T)99 93
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