石蒜体胚发生过程的细胞学和生理特性.pdf
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1、石蒜体胚发生过程的细胞学和生理特性陈依宁,雷雪,李欣,高燕会(浙江农林大学林业与生物技术学院省部共建亚热带森林培育国家重点实验室,浙江杭州311300)摘要:【目的目的】探究石蒜梦幻少女Lycoris chinensisradiataAstroGirl体胚发生过程中的细胞学和生理生化指标的变化规律,明确梦幻少女体胚发生的特征,提高石蒜属 Lycoris 植物种球繁殖效率,为石蒜属新品种工厂化生产提供技术支撑。【方法方法】采用石蜡切片、酶联免疫吸附测定技术和超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术,测定了 040d梦幻少女体胚发生过程中的形态和组织学特征、体胚可溶性淀粉及总蛋白质、抗
2、氧化酶活性和多胺等生理生化指标的变化。【结果结果】体胚发生过程中,从球形胚到短暂膨大约 20d,进一步分化为心形胚、棒状胚和子叶胚,膨大的球形胚后期或心形胚时期基部会形成维管束。体胚发生过程中,总蛋白质和淀粉、抗氧化酶活性发生显著变化,淀粉变化与球形胚的形成呈正相关,与体胚形态建成和体胚成熟呈负相关。总蛋白质、过氧化物酶(POD)活性及过氧化氢酶(CAT)活性变化与子叶胚形成呈正相关,与子叶胚的成熟发育呈负相关。超氧化物歧化酶(SOD)活性变化与球形胚、子叶胚时期呈负相关,与心形胚、棒状胚时期呈正相关,表明储能作用的淀粉、蛋白质及与植物生理密切相关的抗氧化酶对体胚发生起着重要的作用。体胚发生过
3、程中多胺氧化酶(PAO)活性和多胺(PAs)变化显著,腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)的变化共同决定多胺的变化趋势,多胺和多胺氧化酶活性主要在体胚分化早期发生明显积累,与球形胚分化呈正相关;在子叶胚的形成期,精胺与亚精胺呈正相关;在子叶胚成熟期,腐胺、精胺和亚精胺 3 个指标呈现腐胺先下降后上升,精胺、亚精胺先上升后下降的趋势。【结论结论】在梦幻少女体胚发生的 040d,体胚形态经历了原胚球形胚心形胚棒状胚子叶胚的过程。其中,生理特性变化显著,淀粉的积累或消耗可能是球形胚形成、体胚后续形态发育与成熟的重要影响因素。在子叶胚形成及成熟时期,总蛋白质、过氧化酶活性和多胺的变化可能发
4、挥着相应密切的联合作用。多氨氧化酶活性与多胺的活跃积累可能有利于体胚早期发育。图 4 参 32关键词:石蒜属;愈伤组织;体细胞胚;生理生化中图分类号:Q943.1;S682.2文献标志码:A文章编号:2095-0756(2024)02-0243-09CytologicalandphysiologicalcharacteristicsofsomaticembryogenesisinLycorisCHENYining,LEIXue,LIXin,GAOYanhui(StateKeyLaboratoryofSubtropicalSilviculture,CollegeofForestryandBiot
5、echnology,ZhejiangA&FUniversity,Hangzhou311300,Zhejiang,China)Abstract:Objective This study,with an exploration of the changes of cytology and physiological andbiochemicalindexesduringsomaticembryogenesisofLycoris chinensisradiateAstroGirl,whichcanimprovethecoefficientandqualityoftissuecultureandrap
6、idpropagationofAstroGirl,isaimedtoprovide technical support for the factory production of new Lycoris varieties.Method Paraffin section,enzyme-linked immunosorbent assay and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass收稿日期:2023-05-22;修回日期:2023-07-12基金项目:浙江省农业(花卉新品种选育)新品种选育重大科技专项(2021C020
7、71-6);浙江省自然科学基金重点项目(LZ22C160003)作者简介:陈依宁(ORCID:0009-0006-6228-6114),从事观赏植物遗传改良和生物技术研究。E-mail:。通信作者:高燕会(ORCID:0000-0001-8827-9867),副教授,博士,从事观赏植物遗传改良和花色形成机理研究。E-mail:浙江农林大学学报,2024,41(2):243251Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20230321spectrometry(HPLC-MS/MS)wereusedtodete
8、rminethechangesofsomaticembryomorphology,histologyandcorrespondingphysiologicalandbiochemicalindexessuchascontentofsolublestarchandtotalprotein,antioxidantenzymeactivityandpolyaminecontentduringsomaticembryoculture(040d)ofAstroGirl.Result(1)Duringtheprocessofsomaticembryogenesis,theglobularembryolas
9、tedforabout20daysfrominitiation to transient expansion,before it was further differentiated into heart-shaped embryo,rod-shapedembryoandcotyledonembryowithvascularbundlesformedatthebaseoftheenlargedglobularembryoorheart-shapedembryo.(2)Duringsomaticembryogenesis,significantchangesoccurredintheconten
10、toftotalprotein and starch and the activity of antioxidant enzymes.The change of starch content was positivelycorrelatedwiththeformationofglobularembryoandnegativelycorrelatedwithsomaticembryomorphogenesisandsomaticembryomaturation,whereasthechangesoftotalprotein(TP)content,peroxidase(POD)activityan
11、d catalase(CAT)activity were positively correlated with cotyledon embryo formation but negativelycorrelated with cotyledon embryo maturation.The activity of superoxide dismutase(SOD)was negativelycorrelatedwithglobularembryoandcotyledonembryo,butpositivelycorrelatedwithheart-shapedembryoandrod-shape
12、dembryo.Suchresultsshowedthatstarch,proteinandantioxidantenzymeswhicharecloselyrelatedtoplantphysiologyplayanimportantroleinsomaticembryogenesis.(3)Theactivityofpolyamineoxidase(PAO)and the content of polyamine(PAs)changed significantly during somatic embryogenesis,and thecontentsofputrescine(Put),s
13、permine(Spm)andspermidine(Spd)determinedthechangetrendofpolyaminecontent.Polyaminecontentandpolyamineoxidaseactivitymainlyaccumulatedintheearlystageofsomaticembryodifferentiation,whichwaspositivelycorrelatedwithglobularembryodifferentiation,andthechangesofspermineandspermidinecontentwerepositivelyco
14、rrelatedduringcotyledonembryoformation.Inthematurestageofcotyledonembryo,putrescine,spermineandspermidinedecreasedatfirstandthenincreased,whilespermineandspermidineincreasedatfirstandthendecreased.ConclusionDuringthe040daysofsomaticembryogenesis of Astro Girl,the main morphology of somatic embryo de
15、veloped from proembryo,globular embryo,heart-shaped embryo and rod-shaped embryo to cotyledon embryo,among which,thephysiologicalcharacteristicschangedsignificantly,andtheaccumulationorconsumptionofstarchcontentmaybe an important factor affecting the formation of globular embryo and the subsequent m
16、orphologicaldevelopmentandmaturationofsomaticembryo.Duringtheformationandmaturationofcotyledonembryo,thechangesoftotalproteincontent,peroxidaseactivityandpolyaminecontentmayplayacloselyjointrole.Theactive accumulation of polyamine oxidase activity and polyamine content may be beneficial to the early
17、developmentofsomaticembryos.Ch,4fig.32ref.Key words:Lycoris;callus;somaticembryo;physiologyandbiochemistry石蒜属 Lycoris 植物为多年生球根花卉,花型奇特且类型繁多,花色丰富,冬春花败观其叶,夏秋叶枯赏其花,观赏价值高1。此外,石蒜属植物含有的生物碱、石蒜碱颇具医药研究开发潜力23。石蒜新品种梦幻少女Lycoris chinensisradiataAstroGirl是中国石蒜 L.chinensis 和石蒜 L.radiata 的种间杂交种,其花色以乳黄白色为底色,雾粉渐变于花瓣末端
18、,花朵形态优雅折曲,同样渐变色的花丝抽展而出,呈现梦幻、活力、雅致的观赏感,极具研究和推广价值,但梦幻少女染色体数目(2n=19)为非整倍数,自然条件下种球繁殖效率低,速度慢。植物组织培养技术成为目前推广新品种和良种的重要手段。该技术具有材料耗费量少、繁殖系数高、不受季节限制、周期短和快速批量成苗的特点,能够良好地保持繁殖母本遗传基因型,从而获得优良稳定材料。至今已建立多种石蒜属植物的组培快繁体系4,但主要以带基盘的双鳞片或鳞茎为外植体,通过诱导不定芽来建立离体快繁体系,繁殖系数相对较低。通过体胚发生途径,可获得数量更多、244浙江农林大学学报2024 年 4 月 20 日发育速度更快、遗传性
19、更稳定的再生植株,在栎属 Quercus5、松科 Pinaceae67及云杉属 Picea8等植物建立的体胚发生体系,加速了林木育种改良、苗木工程绿化、有效成分提取及种质资源保护与利用等方面的应用。然而,多数植物体胚的研究仍存在体胚形成再生植株困难和发育不同步等瓶颈9。关于石蒜属植物体胚相关的研究,仅王彩霞等10通过诱导忽地笑 Lycoris aurea 鳞茎盘端 1/3 鳞茎的愈伤组织,进而分化体胚,而关于石蒜属其他种的体胚研究还相对较少。鉴于此,本研究分析了石蒜梦幻少女体胚发生过程中的细胞学与生理特性,探索其体胚繁殖体系及发育机理,为石蒜属植物工厂化育苗提供技术支撑。1材料与方法1.1植物
20、材料与培养条件将石蒜鳞茎球不同部位组织为外植体,诱导愈伤组织。在愈伤组织连续增殖继代中,筛选稳定增殖的淡黄色、半透明的胚性愈伤组织,再将胚性愈伤组织进行体细胞胚的诱导与增殖培养,筛选出 D23 培养基 基础培养基(MS)+2.00mgL16-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.05mgL12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+30.00gL1蔗糖+6.20gL1琼脂 为最佳的体胚诱导与增殖培养基。培养条件:光周期 14hd1,光照 1500lx,温度(272),以下研究培养条件相同。2022 年 7 月选取生长一致的胚性愈伤组织,接种至 D23 培养基进行培养,间隔 5d(0、5、10、15、20、25
21、、30、35 和 40d)挑选长势相对一致的材料,体视镜(OLYMPUSSZX7)显微观察并拍照,同时,取 10g 材料液氮速冻后于80 超低温冰箱中保存,用于生理生化指标测定,重复 3 次。1.2石蜡切片制作与观察石蜡切片参照李丹等11的方法改良后进行,取材固定 3d 以上,梯度乙醇脱水、浸蜡,之后于 65融化石蜡连续浸蜡 8d,新蜡包埋、切片(厚度 9m)、制片,40 烤片至干燥,常温保存备用。脱蜡复水,染色(苏木素中染色 45min,盐酸水溶液分化 5s,氨水水溶液返蓝 30s 内,自来水浸洗),依次于体积分数为 85%、95%的乙醇脱水各 5min,伊红染液染色 5min,乙醇脱水,中
22、性树胶封片,于徕卡(LEICADM4000)显微镜观察拍照。1.3生理生化指标测定1.3.1淀粉、总蛋白质和酶活性测定称取 0.1g 样品置 2.0mL 离心管中,加入 1.0mL 磷酸缓冲液(pH7.4)和适量研磨珠,于10 预冷的冷冻研磨机中研磨,48000rmin1离心20min,取上清液,冰上保存备用。采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试剂盒(GIVEI,极威生物科技公司,上海)测定淀粉、总蛋白质和酶活性12。在预先包被抗体的孔板中,依次加样、温浴、清洗、显色后,于酶标仪(SPECTRAMAX190)上测定 D(450),计算样品的质量浓度或活性。1.3.2多胺提取参考林绍艳等13方法将
23、 1.0gL1腐胺、精胺和亚精胺混合标准品溶液,稀释成10.0mgL1,再逐级稀释 2、4、8、16、32、64、128 倍,上机测定其峰面积,并以多胺质量分数为自变量,峰面积为因变量,绘制标准曲线。称取 0.1g 各样品冻干粉末于离心管中,加入预冷的体积分数为 10%的乙腈 2.0mL,涡旋混匀,9000rmin1离心 5min,0.22m 滤膜过滤,使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测量样品的多胺质量分数。1.4数据处理采用 Excel2022 整理数据,SPSS23.0 对生理生化指标进行单因素方差分析和多重比较(邓肯检验),使用 GraphPadprism9.0 制图
24、。2结果与分析2.1石蒜体胚发生过程中的形态变化组织学观察表明:在接种的第 015 天时,胚性愈伤组织呈浅黄色透明状。刚接种时,愈伤组织表面为鲜润、淡白色的颗粒状团块,胚性细胞在愈伤组织表层或亚表层散状分布,内层多为较大的非胚性第 41 卷第 2 期陈依宁等:石蒜体胚发生过程的细胞学和生理特性245细胞疏松排列;接种第 5 天时,愈伤组织逐渐适应培养环境,表面湿润,表层附近的胚性细胞开始活跃分裂,且密集分布;第 10 天时,愈伤组织发生了一定程度的增殖,球形胚初步形成并向外凸出;第15 天时,愈伤组织主要发生增殖与分化球形胚,少量心形胚和棒状胚形成,心形胚维管束形成,与母体愈伤组织形成生理隔离
25、(图 1)。形态学特征形态学特征组织学特征组织学特征0 d5 d10 d15 d20 d25 d30 d40 d35 d2 000 m2 000 m2 000 m2 000 m2 000 m2 000 m300 m300 m300 m300 m300 m300 m300 m300 m300 m2 000 m2 000 m2 000 m图1体胚发生过程的 040d 组织细胞学变化Figure1Histocytologicalchangesofsomaticcellembryogenesisduring040days在培养的第 2040 天时,胚性愈伤组织转变为光亮、浅黄色。在第 20 天时,愈伤
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