熊果酸对压力超负荷心肌肥厚保护作用机制初步研究.pdf
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1、中国体外循环杂志2023年10月10日第21卷第5期 Chin J ECC Vo1.21 No.5 October 10,2023熊果酸对压力超负荷心肌肥厚保护作用机制初步研究石广永,张冰,赵琳,陈亚武,金振晓,徐学增 摘 要:目的 探究熊果酸抗心肌肥厚的作用及其机制。方法 提取并培养乳鼠原代心肌细胞,用苯肾上腺素(PE)诱导心肌细胞肥厚。通过免疫荧光染色计算心肌细胞平均横截面积,通过二氯荧光素染色检测胞内活性氧(ROS)水平,应用定量聚合酶链反应和免疫印迹评估心肌细胞肥厚相关分子和抗氧化相关分子的转录和表达水平。结果 熊果酸显著减小了PE诱导的心肌细胞横截面积(P0.05),降低了肥厚相关分
2、子Nppb(BNP编码基因)和Myh7(-MHC 编码基因)的转录水平(P0.01)及肥厚相关分子脑钠肽(BNP)和-肌球蛋白重链的表达量(P0.001,P0.01);熊果酸显著抑制了 PE诱导的心肌细胞中 ROS水平(P0.01),增加了抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD2)和过氧化氢酶(CAT)的表达水平(P0.01)以及过氧化物酶体增殖物激活受体辅助活化因子1(PGC-1)的表达水平(P0.001)。给予PGC-1的抑制剂SR-18292后,熊果酸减轻PE处理后心肌细胞肥厚、抑制肥厚相关分子转录及表达、降低胞内ROS水平及增加胞内抗氧化酶的能力均消失。结论 熊果酸提高PGC-1的表达,增加胞
3、内抗氧化酶SOD2和CAT的表达量,减少心肌细胞内ROS水平,发挥抵抗心肌肥厚的作用。关键词:熊果酸;心肌肥厚;过氧化物酶体增殖物激活受体辅助活化因子1;活性氧A preliminary study on the protective mechanism of ursolic acid against pressure over-load induced cardiac hypertrophyShi Guangyong,Zhang Bing,Zhao Lin,Chen Yawu,Jin Zhenxiao,Xu XuezengDepartment of Cardiovascular Surger
4、y,Xijing Hospital,Air Force Medical University,Shaanxi Xian 710032,ChinaCorresponding author:Xu Xuezeng,Email: Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of ursolic acid on myocardial hypertrophy.Methods Primary cardiomyocytes from lactating mice were isolated and cultured,and cardio
5、myocyte hypertrophy was induced by phenylephrine(PE).The mean cross-sectional area of cardiomyocytes was calculated by immunofluorescence staining,intracellular reactiveoxygen species(ROS)were detected by dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)staining,and the transcription and expressionlevels of hy
6、pertrophic and antioxidation-related molecules in cardiomyocytes were evaluated by quantitative polymerase chain reaction(PCR)and western blotting.Results Ursolic acid significantly decreased the cross-sectional area of myocytes induced byPE(P0.05),and decreased the transcription levels of hypertrop
7、hic molecules Nppb and Myh7(P0.01),and the expression levels of hypertrophic molecules BNP(P0.001)and-MHC(P0.01).Ursolic acid significantly inhibited ROS levels in PE induced cardiomyocytes(P0.01),and increased the expression levels of SOD2 and CAT(P0.01)and PGC-1(P0.001).Afterthe administration of
8、SR-18292,an inhibitor of PGC-1,the ability of ursolic acid to reduce myocyte hypertrophy,inhibit transcription and expression of hypertrophy related molecules,decrease intracellular ROS levels,and increase intracellular antioxidant enzymes after PE treatment was disappeared.Conclusion Ursolic acid e
9、xerts resistance to cardiac hypertrophy by enhancing the expression of PGC-1,increasing the expression of the intracellular antioxidant enzymes SOD2 and CAT,and decreasingintracellular ROS levels in cardiomyocytes.Key words:Ursolic acid;Myocardial hypertrophy;PGC-1;Reactive oxygen species根据世界卫生组织的数据
10、,每年全球5 500万例死亡中有近4 100万例死于非传染性疾病,占全球死亡人数的75%。非传染性疾病包括自身免疫性疾病、糖尿病、癌症、脑卒中、呼吸系统疾病、心血管疾病和其他疾病。在死亡的4 100万人中,1 790万人死于心血管疾病,占全球死亡总数的31%,这使得心血管疾病成为世界上死亡的主要原因1。熊果酸是一种天然的五环三萜,存在于苹果、基金项目:国家自然科学基金(82000227)作者单位:710032 西安,空军军医大学第一附属医院心血管外科通信作者:徐学增,Email:DOI:10.13498/ki.chin.j.ecc.2023.05.11298中国体外循环杂志2023年10月10
11、日第21卷第5期 Chin J ECC Vo1.21 No.5 October 10,2023浆果、树叶和花中。研究表明,熊果酸具有强大药效学特性和生物活性2。熊果酸可在包括大脑、肝脏、肾脏、心脏、肺、膀胱、结肠和脾脏等器官中储存并积聚,发挥广泛的生物活性,能够预防和治疗代谢紊乱、慢性炎症疾病、癌症和神经系统疾病3。已有很多研究报道,熊果酸具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤以及抗高血压等多种生物活性4。然而,熊果酸是否可以抵抗压力超负荷心肌肥厚,保护心脏尚不清楚。本研究在体外细胞实验水平,探究熊果酸抗心肌肥厚的作用并初步研究其机制,为压力超负荷病理性心肌肥厚提供潜在的治疗药物。1材料和方法1.1
12、主要试剂材料新生(13 d)Sprague-Dawley仔鼠购自空军军医大学实验动物中心。熊果酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,反转录试剂盒及定量试剂均购自北京启衡星生物科技有限公司,-肌动蛋白(-actinin)购自武汉赛维尔生物科技有限公司,苯肾上腺素(phenylephrine,PE)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,抗脑利钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)抗体、抗-肌球蛋白重链(myosin heavy chain,-MHC)抗体、抗心房钠肽(atria natriuretic peptide,A
13、NP)抗体、抗磷酸甘油醛脱氢酶(phosphoglyceraldehyde dehydrogenase,GAPDH)抗体以及抗超氧化物歧化酶 2(superoxide dismutase-2,SOD2)抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司,抗过氧化氢酶(Catalase,CAT)抗体及抗过氧化物酶体增殖物激活受体辅助活化因子1(peroxisome proliferator-activated receptor-coactivator-1,PGC-1)抗体均购自abcam公司,辣根酶标记山羊抗兔IgG和辣根酶标记山羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司,化学发光液购自 Roche 公司
14、,胎牛血清购于Gibco公司。1.2 方法1.2.1 原代心肌细胞的提取与培养 新生大鼠仔鼠经过75%酒精消毒两次,从前胸进行T形切开,暴露心脏并取下。于冰浴磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer saline,PBS)中冲洗后,剪去心房组织并收集心室部分于青霉素小瓶中。用眼科剪剪碎后,加入胰蛋白酶消化3 min后弃去上清。将组织转移到另一个干净的青霉素瓶中,用胶原酶继续消化。每50 min将上清液吸取至含有血清的DMEM/F12培养基中,沉淀中加入新的胶原酶,直至组织块被完全消化。消化液以1 000 rpm离心3 min,弃去上清后加入新的培养基。用70 m单细胞过滤器过滤溶液,然后差
15、速贴壁2 h去除成纤维细胞。心肌细胞以5105密度接种于6孔、12孔或爬片。37,95%空气和5%CO2中放置48 h后可以使用。加入终浓度为50 mol/L的PE处理原代心肌细胞48 h诱导心肌细胞肥大。1.2.2免疫荧光染色心肌细胞经过处理后,PBS洗涤3次后加入4%多聚甲醛,室温固定20 min后用 PBS再洗涤 3次。用 0.03%TritonX-100进行透化处理后,于4下用-actinin过夜孵育,PBS洗涤3次,在室温下用山羊抗小鼠二抗孵育2 h。用PBS洗涤三次,用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色细胞核。最后
16、于共聚焦显微镜下观察并拍照,采用Image J软件测量心肌细胞表面积。1.2.3ROS 检测将 2,7-二氯荧光素二乙酸酯(2,7-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)原代心肌细胞培养基中,于共聚焦显微镜下观察并拍照,采用Image J软件测量荧光强度。1.2.4 定量PCR 心肌细胞经过处理后,PBS洗涤3次加入Tizol,按照总RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取。经过Nano Drop定量后,按照反转录试剂盒说明书进行反转录。反转录结束后,按照定量试剂盒进行定量PCR,循环为:9530 s、9510s、6030 s、655 s,40个循环。用2-
17、Ct方法定量mRNA表达水平。1.2.5 免疫印记 心肌细胞经过处理后,PBS洗涤3次,加入裂解缓冲液,刮取细胞并充分裂解。412 000 rpm离心 10 min去除细胞碎片,保留上清。经过蛋白定量后,加入5倍上样缓冲液。经过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳后,进行聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)转膜。用5%脱脂奶粉溶液进行封闭后,在4中一抗孵育过夜。一抗稀释度为1 1000(GAPDH 稀释度为 1 5 000)。PV
18、DF 膜条用TBST洗涤 3次后,用辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育2 h。二抗的稀释度为1 2 000。用TBST洗涤 3 次后,滴加化学发光液并用 ChemiDox XRS进行拍照并定量。1.2.6 统计分析数值以平均值+标准差表示。多组间采用单因素方差分析对数据进行统计分析。以P0.05作为具有统计学意义。2 结 果299中国体外循环杂志2023年10月10日第21卷第5期 Chin J ECC Vo1.21 No.5 October 10,20232.1熊果酸具有减轻 PE 诱导的心肌肥厚的作用为了检测熊果酸抗心肌肥厚的作用,本研究建立了PE诱导的原代心肌肥厚细胞模型并给予熊果酸处理。
19、心肌细胞-actinin染色典型图如图1A所述。原代心肌细胞给予PE处理以后,心肌细胞的平均横截面积从(1 072.4127.2)m2增加到了(3 204.1367.2)m2(P0.05,图1B)。经过熊果酸处理后,与PE处理组相比,细胞的横截面积降低了 26.81%,(P0.05,图1B)。如图 1C 所示,与 PBS 组相比,经过 PE 处理后,心肌细胞肥厚标志分子Nppb(BNP编码基因)和Myh7(-MHC编码基因)的转录水平显著升高(均P0.001);与PE组相比,经过给予熊果酸处理后,心肌细胞肥厚标志分子Nppb和Myh7的转录水平显著降低(均P0.01)。如图1E所示,与PBS组
20、相比,经过PE处理后,心肌细胞肥厚标志分子BNP和-MHC 的表达水平显著升高(均P0.001);与PE组相比,经过给予熊果酸处理后,心肌细胞肥厚标 志 分 子 BNP 的 表 达 水 平 降 低 了 28.14%(P0.001),-MHC 的表达水平降低了 35.95%(P0.05,图2B)。原代心肌细胞给予PE处理以后,心肌细胞的活性氧水平显著升高(P0.001,图 2B)。经过熊果酸处理后,与PE处理组相比,心肌细胞中活性氧的水平显著降低39.21%(P0.01,图2B)。与PBS组相比,经过PE处理后,心肌细胞中抗氧化酶SOD2和CAT的水平显著降低(均P0.001,图2D-E);与P
21、E组相比,经过给予熊果酸处理后,心肌细胞中抗氧化酶SOD2和CAT的水平显著升高(均P0.01,图2D-E)。同时免疫印迹法的结果也表明,与PBS组相比,PE处理后心肌细胞中 PGC-1 的水平显著降低(P0.01);与 PE 组相比,加入熊果酸后,心肌细胞中PGC-1 的水平显著升高(P0.001,图 2F)。这提示熊果酸具有增加心肌细胞抗氧化能力的作用,且该作用可能与PGC-1相关。2.3PGC-1抑制剂逆转熊果酸抗PE诱导心肌肥厚的作用为了检测熊果酸抗心肌肥厚的作用是否与PGC-1相关,本研究使用了PGC-1的特异图1 熊果酸具有减轻PE诱导的心肌肥厚的作用注:A:心肌细胞-actini
22、n染色典型图;B:心肌细胞平均横截面积;C:心肌细胞中肥厚相关Nppb和Myh7的转录水平;D:心肌细胞中肥厚相关分子免疫印记法典型图;E:心肌细胞中肥厚相关分子BNP表达量统计;F:心肌细胞中肥厚相关分子-MHC表达量统计。与PBS组比较,*P0.001;与PE组比较,#P0.05,#P0.01,#P0.001。PBS:磷酸盐缓冲液;UA:熊果酸;PE:苯肾上腺素;BNP:脑利钠肽;-MHC:-肌球蛋白重链;Nppb:BNP编码基因;Myh7:-MHC编码基因300中国体外循环杂志2023年10月10日第21卷第5期 Chin J ECC Vo1.21 No.5 October 10,202
23、3性抑制剂SR-18292进行研究。心肌细胞-actinin染色典型图如图3A所述。与单纯PE组相比,给予熊果酸处理后,原代心肌细胞平均横截面积降低了24.17%(P0.05,图 3B)。如图 3C 所示,与单纯PE组相比,经过熊果酸处理后,心肌细胞肥厚标志分子Nppa和Nppb的转录水平显著降低(均P0.001),Myh7的转录水平降低了 38.31%(P0.05)。如图3E所示,与单纯PE组相比,经过熊果酸处理后,心肌细胞肥厚标志分子BNP和-MHC的表达水平显著降低(P0.001及P0.05,图 3E-F)。这提示PGC-1抑制剂逆转熊果酸抗PE诱导心肌肥厚的作用与PGC-1相关。2.4
24、PGC-1抑制剂逆转熊果酸增加心肌细胞抗氧化能力的作用为了检测熊果酸增加心肌抗氧化能力是否与 PGC-1 相关,本研究检测了给予SR-18292后心肌细胞中的ROS水平和抗氧化酶的表达水平。心肌细胞ROS染色典型图如图4A。与单纯 PE组相比,给予熊果酸处理后,心肌细胞的ROS水平显著降低(P0.05,图4B)。如图4C-E所示,与单纯PE组相比,经过熊果酸处理后,心肌细胞中抗氧化酶SOD2表达水平显著升高(P0.001),抗氧化酶CAT表达水平显著升高(P0.05)。这提示 PGC-1抑制剂逆转熊果酸增加心肌细胞抗氧化能力的作用。图2 熊果酸具有减轻PE诱导的心肌细胞中氧化的作用注:A:心肌
25、细胞2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色典型图;B:心肌细胞DCFH-DA荧光强度统计;C:免疫印记法典型图;D:心肌细胞中SOD2表达量统计;E:心肌细胞中CAT表达量统计;F:心肌细胞中PGC-1表达量统计。与PBS组比较,*P0.01,*P0.001;与PE组比较,#P0.01,#P0.001。PBS:磷酸盐缓冲液;UA:熊果酸;PE:苯肾上腺素;SOD2:超氧化物歧化酶2;CAT:过氧化氢酶;PGC-1:过氧化物酶体增殖物激活受体辅助活化因子1301中国体外循环杂志2023年10月10日第21卷第5期 Chin J ECC Vo1.21 No.5 October 10,20
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- 果酸 压力 超负荷 心肌 肥厚 保护 作用 机制 初步 研究
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