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毕业设计-壳聚糖衍生物的制备及其抗新城疫病毒活性研究.doc
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1、密级:,硕 士 学 位 论 文壳聚糖衍生物的制备及其抗新城疫病毒活性研究 2015年 05月原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任人由本人承担。论文作者签名: 日期:学位论文版权使用授权书本人完全了解中国科学院海洋研究所有关保留、使用学位论文的规定,同意海洋研究所保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版,允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国科学院海洋研究所可以将本学位
2、论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。(保密论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签字: 日期:导师签字: 日期:The preparation of chitosan and its derivatives and their inhibition effect on Newcastle disease virusBy He Xiaofei(Marine Pharmacology)Directed by Xing RongeA Dissertation Submitted toThe University of Chinese Ac
3、ademy of SciencesIn partial fulfillment of the requirementFor the degree ofMaster of ScienceInstitute of Oceanology, Chinese Academy of SciencesMay, 2015致谢时光匆匆而逝,三年好似昨天。一年的北上求学,两年的实验探索,时至今日已接近尾声。十分感谢三年来,我的指导老师邢荣娥老师,在生活和学习上给予的悉心指导与帮助,让我对过去充满怀念、对现在充满感恩、对以后充满信心。邢老师以其热情开朗的生活态度、严谨客观的研究认识、努力认真的工作作风深深影响着我。
4、从生活琐事到实验注意,事事躬亲,对学生关心爱护极佳。万分荣幸,能有这样一位博学、谦逊、严谨而又善良的老师指导我青春里最重要的道路。愿老师在以后的工作生活中,万事如意,幸福安康!十分感谢三年来课题组李鹏程老师的关心与指导,生活中,李老师平易近人、关心学生;科研中,李老师严谨认真,锐意创新。谆谆教诲、高尚师德学生永不敢忘,谨此毕业之际,特向李老师表达学生深深的感谢之情,望您身体健康,合家欢乐!在三年的学习生活中,感谢刘松老师、于华华老师、李克成老师、秦玉坤老师、王雪芹老师、李荣锋老师、陈晓琳老师给予的极大帮助与指导,在此特别表示感谢。感谢罗丰雷师姐、邹平师姐、杨皓月师姐、王晶师姐、李俨师兄、宋琳师
5、姐、张恩惠师兄、周苗苗、岳洋、黄勇师弟、张晓倩师妹、刘卫翔师弟、金秋师妹、孙雨豪师弟、杨悦师妹等实验室兄弟姐妹们给予的支持与帮助,在此一并表示感谢。特别感谢奥兰百特尹燕博老师课题组对抗病毒实验的支持与指导,感谢张全斌老师课题组在仪器设备上的帮助与支持,也感谢家人一直以来的关心、支持与体谅。学生 何晓飞摘要新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性、急性败血性传染病。目前针对鸡新城疫病毒主要采用疫苗方法,以预防为主。近年来大量研究表明,海洋生物多糖具有抗病毒和提高机体免疫力的活性。壳聚糖作为天然存在的唯一带正电荷的多糖,具有调节免疫、抗肿瘤、抗菌、
6、降脂、保湿等非常好的生理活性,且研究发现,壳聚糖及其衍生物可抑制几十种植物病毒、类病毒的侵染。但其是否具有抗新城疫病毒活性,国内外还未见报道。因此,本文以不同分子量、不同结构类型、不同基团修饰的-壳聚糖、-壳聚糖和6-胺取代-6-脱氧壳聚糖衍生物为研究对象,鸡胚尿囊液中血凝效价的降低作用为指标,筛选出最佳抗鸡新城疫病毒的产品;同时,采用荧光定量PCR技术,测定免疫因子的变化,以此确定壳聚糖及其衍生物在对抗新城疫病毒的过程中,对于免疫系统的激活与调控,从而确定壳聚糖及其衍生物对于机体免疫系统的影响及药效机制。具体结果如下:测试样品均具有抗新城疫病毒活性,分子量、分子结构、修饰基团、产品浓度和接种
7、方式对活性影响显著。1)-壳聚糖和-壳聚糖抑制新城疫病毒的最佳分子量分别为4513Da和5743Da;2)-壳聚糖的抗新城疫病毒活性明显优于-壳聚糖,-壳聚糖在分子量为3kDa-6kDa时,在直接抑制病毒的接种方式下可有效降低血凝效价至0,效果非常显著;3)6-脱氧-N-邻苯二甲酰基壳聚糖和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖显著提高了抗新城疫病毒活性,在直接抑制病毒的试验中可有效降低血凝效价至0;4)在浓度方面,8g/L分子量为3624Da和2g/L分子量为5743Da的-壳聚糖, 1g/L的6-脱氧-N-邻苯二甲酰基壳聚糖和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖均能将新城疫病毒血
8、凝效价降至0。荧光定量PCR的测定结果表明:低分子量-壳聚糖、-壳聚糖都能有效增加IL-2、IFN-、IFN-、TNF-等免疫因子的转录,但并没有导致病毒RNA的明显下降。经胺取代修饰的壳聚糖衍生物虽然具有显著的抗新城疫病毒效果,但对于免疫因子转录影响表现独特,有效降低了病毒RNA。因此,-壳聚糖和6-胺代-6-脱氧壳聚糖衍生物的抗病毒机理应有所不同,值得我们进一步研究。本文研究为获得一种绿色低毒、治疗有效、价格低廉的抗新城疫病毒药物提供了可能,同时,对于免疫损伤性疾病新城疫的研究也为我们系统性研究治疗其他免疫损伤性疾病打下了重要基础。关键词不同分子量-壳聚糖 不同分子量-壳聚糖 6-胺代-6
9、-脱氧壳聚糖衍生物 新城疫病毒 抗病毒机理ABSTRACTNewcastle disease (ND) is an acute septic and contact susceptible infectious disease caused by Newcastle disease virus (NDV). It resulted in blooding in respiratory tract and digestive tract mucosa. Currently, the treatments against ND are mainly adopts the prevention me
10、thods vaccines. In recent years, a large number of studies have shown that marine polysaccharide has antiviral activity and improve the body immunity. Chitosan as an only positively charged natural polysaccharide has terrific biological activities, such as the increase of immunity, antitumor, antiba
11、cterial, lipid-lowering and moisturizing. Whats more important, chitosan and its derivatives were found that they can inhibit dozens of plant virus and viroid infection. But if it against NDV has not been reported at home and abroad.Therefore, we take chitosan with different molecular weight (Mw), d
12、ifferent modified groups and different form as research object in this article to select the best product against Newcastle disease virus. The results indicated by the hemagglutination titer of allantoic fluid in chicken embryo. At the same time, using the fluorescent quantitative PCR technology, we
13、 detected the change of immune factors in order to determine that if the chitosan and its derivatives has activated and regulated the immune system in the process of antiviral. Its useful to determine the influence of chitosan and its derivatives on the bodys immune system and its efficacy mechanism
14、. Specific results are as follows:All test samples have antiviral activity against NDV influenced by Mw, modified group, the concentration of the product and the way of vaccination significantly. 1) The best Mw of -chitosan and -chitosan are 4513Da and 5743Da respectively; 2) -chitosans antiviral ac
15、tivity is superior to -chitosan. -chitosan with 3KDa-6KDa Mw effectively reduced blood clotting titer to 0 in the direct inhibiting virus group. 3) 6-deoxidation-N-phthalic acyl chitosan and 6-deoxidation-6-bromine-N-phthalic acyl chitosan significantly improve the antiviral activity in direct inhib
16、iting virus group which reduce blood clotting titer to 0. 4) In terms of concentration, 8 g/L 3624Da and 2 g/L 5743Da -chitosan and 1 g/L 6-deoxidation-N-phthalic acyl chitosan and 6-deoxidation-6-bromine-N-phthalic acyl chitosan dropped the hemagglutination titer of NDV to zero.Results from fluores
17、cence quantitative PCR showed that both -chitosan and -chitosan effectively increased the transcription of immune factors such as IL-2, IFN-, TNF-, IFN-, while not lead to a sharp decline in viral RNA. Although amine modified chitosan derivatives have significant effect on NDV, the transcription of
18、immune factors performed specially, which reduced the viral RNA effectively. Therefore, we thought that the antiviral mechanism of -chitosan and 6-amine-6- deoxidization chitosan should be different which worth further research.This article made a road lead to obtain a green, inexpensive and effecti
19、ve drug against NDV. At the same time, it also made an important foundation for the systemic research of the treatment of other immune injury disease. KEY WORD-chitosan with different molecular weight -chitosan with different molecular weight 6-amine-6-deoxidation chitosan Newcastle disease Virus An
20、tiviral mechanism第一章 绪论1.1 新城疫病毒的介绍及防治现状新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性、急性败血性传染病1, 2。按病毒毒力可分为强毒株和弱毒株3,按临床表现可分为速发性嗜内脏型、速发性嗜肺脑型、中发型新城疫和缓发型新城疫。鸡新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟,主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血,死亡率高,危害严重4-6。仅2005年,发病家禽就高达168万只,给我国经济造成重大损失,是危害养鸡业健康发展的三大主要疫病(鸡马立克氏病,鸡新城疫,鸡传染性法氏囊病)之一7。具有分布范围广、易感禽类多、经济损
21、失大、影响国际贸易等特点8。鸡新城疫病毒是具有囊膜的单股、负链和不分节段的RNA病毒9,通过羽毛、皮肤上皮细胞与粘液等第一道防线进入体内,在杀菌物质及吞噬细胞等第二道防线的作用下控制一部分病毒的入侵,同时也对吞噬细胞造成损伤,这属于非特异性免疫部分10, 11。而进入第三道防线,特异性免疫阶段则分为免疫器官和免疫细胞两部分,鸡法氏囊和哈德氏囊是重要的免疫器官。哈德氏腺及其导管系统中存在淋巴细胞群,进一步研究证实它是以B细胞为主(占淋巴细胞80%)的外周淋巴器官,是局部免疫的重要参与者。通过局部反应产生特异抗体,由腺管上皮细胞以顶浆分泌方式排至腺管,集成泪液。通过鼻泪管到达鼻腔再进入口腔和上呼吸
22、道并保持强烈中和活性而起到局部免疫作用。可见到达这些部位的抗体不是血液中循环抗体的机械渗透而是来源于哈德氏腺ND局部免疫的发生部位,正是NDV的入侵门户12。HN糖蛋白在病毒侵染过程中,可识别细胞受体,介导病毒吸附于细胞膜,F蛋白参与病毒的穿透、细胞融合和溶血等过程,是决定NDV致病性的主要因素。HN呈血凝素及神经氨酸酶活性,F蛋白与细胞融合及病毒穿透细胞作用有关13, 14。鸡新城疫作为免疫抑制性疾病,在病毒早期感染雏鸡时病毒先在胸腺T细胞和骨髓多能干细胞内生长,并损伤破坏这些细胞,使骨髓系祖细胞的增殖受抑制,进而影响T细胞和B细胞等免疫细胞的形成。同时病毒的侵入还破坏了法氏囊内的免疫细胞和
23、内皮细胞,由于这些免疫活性细胞被破坏,当用ND疫苗进行免疫时刺激机体巨噬细胞加工抗原、传递信息的能力减少,各种免疫细胞的减少和功能的降低致使机体发生免疫抑制现象或产生的免疫应答减少,不能抵抗新城疫野毒的感染而发生非典型的新城疫15。病毒性疾病与细菌性疾病不同,特效疗法较少,主要的防治手段有疫苗、化学合成药物及干扰素等16。通常药物并不能中断病毒感染,因此预防措施就显得尤为重要17。目前新城疫的防治主要以疫苗预防为主,由于价格便宜,免疫时间快,多使用LASOTA弱毒疫苗,但是效果不佳。虽然有多种疫苗和免疫方法,但是该病的发病率却仍是居高不下10, 18。其主要原因有母源抗体的干扰、病毒引起的免疫
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