化脓隐秘杆菌CmlA和FloR外排泵抑制剂的筛选_李旭领.pdf

动物医学进展，（）：化脓隐秘杆菌 和 外排泵抑制剂的筛选李旭领，王述琪，林雨菲，张泽辉，郭玉茹，蔡宜彤，田春莲，王盈予，崔璨璨，刘明春（沈阳农业大学动物科学与医学学院，辽宁沈阳 ；中国医科大学中英联合学院，辽宁沈阳 ）摘要：为了筛选出效果较好的外排泵抑制剂，对化脓隐秘杆菌进行了耐药基因检测、药敏试验、联合药敏试验和尼罗红外排试验。结果显示，、基因的检出率分别为、和 ，未检出 、基因；槲皮素、木犀草素、黄芩苷、川陈皮素、芹菜素等种黄酮类化合物对化脓隐秘杆菌均具有良好的抗菌效果；其中木犀草素与种酰胺醇类药物联用后均有相加作用，；种黄酮类化合物均可以抑制 和 外排蛋白对尼罗红的外排，其中木犀草素的外排抑制能力最强。耐药消除试验发现，木犀草素可以不同程度的消减化脓隐秘杆菌对酰胺醇类药物的耐药性。结果表明，木犀草素可通过抑制 和 的外排作用，逆转化脓隐秘杆菌对酰胺醇类药物的耐药性，为木犀草素作为天然外排泵抑制剂的临床开发利用奠定了基础。关键词：化脓隐秘杆菌；黄酮类化合物；外排泵抑制剂；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）化脓隐秘杆菌（）是一种革兰氏阳性菌，可引起动物乳房炎、子宫内膜炎等疾收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（，）作者简介：李旭领（），女，内蒙古锡林郭勒盟人，硕士研究生，主要从事兽医药理学与毒理学研究。通讯作者 ，（.，；.，）：.，.（：，），.，.，.：；DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.010病，给养殖业造成较大损失。酰胺醇类药物因其抗菌谱广、抗菌活性强且价格较为低廉成为了治疗细菌性感染的首选药物之一，但是由于对其不合理及大量的使用，致使化脓隐秘杆菌等病原菌对其产生了不同程度的耐药性。细菌产生多药耐药性的原因有很多，外排作用是其中的主要原因之一。和 蛋白属于主要易化子超家族（，）的外排转运蛋白，介导细菌对酰胺醇类药物的耐药性。本实验室前期研究表明，株奶牛子宫内膜炎源化脓隐秘杆菌对氟苯尼考呈现耐药，且基因盒中携带 基因；等对株奶牛肺炎源化脓隐秘杆菌研究发现，其对氯霉素和氟苯尼考均耐药，且类整合子中携带 基因；有试验分析了大肠埃希氏菌对酰胺醇类药物耐药情况，发现其对氯霉素、氟苯尼考均高度耐药，且 、基因检出率均高于。据报道，抑制外排蛋白的外排作用可以逆转细菌耐药性，如公认的外排泵抑制剂利血平、维拉帕米和氰氯苯腙（）等，但这些化合物都因具有一定的毒性而不能广泛应用于临床。木犀草素、槲皮素、黄芩苷等黄酮类化合物不仅具有良好的外排抑制活性，并且具有低毒的优点。但尚未见有关该类化合物对化脓隐秘杆菌 和 外排作用影响的相关报道。本研究选用化脓隐秘杆菌为研究对象，考察黄酮类化合物对 和 的外排抑制作用，并初步探索其作用机制，为天然外排泵抑制剂的临床开发利用提供理论依据。材料与方法材料 试 验 药 品氯 霉 素（）、甲 砜 霉 素（）、氟苯尼考（），中国兽医药品监察所产品；木犀草素（），上海纯优生物有限公司产品；槲皮素（）、黄芩苷（）、川陈皮素（）、芹菜素（），大连美仑生物技术有限公司产品。试验菌株 株化脓隐秘杆菌均于沈阳农业大学动物科学与医学学院动物药学教研室保存。其中 株为子宫内膜炎源化脓隐秘杆菌，编号为；株 是 乳 房 炎 源 化 脓 隐 秘 杆 菌，编 号 为 ；化脓隐秘杆菌 用作质控菌。试剂与培养基（）（）培养基、营养肉汤（），北京索莱宝有限公司产品；胎牛血清，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品；、（、）、核酸染料，宝日医生物技术（北京）有限公司产品；二甲基亚砜（）、溶菌酶，大连美仑生物有限公司产品；尼罗红，上海源叶生物科技有限公司产品；氰氯苯腙，上海麦克林生化科技有限公司产品；葡萄糖，上海豪申化学试剂有限公司产品，细菌基因组 提取试剂盒，北京天根生化有限公司产品。主要仪器 仪（），美国 公司产品；凝胶成像系统（），上海洁诚生物 科 技 有 限 公 司 产 品；酶 标 仪（），澳大利亚帝肯公司产品。方法试剂与药品的配制准确称取各试剂和药品粉 末 适量，采 用 合 适 溶剂，配 制成尼罗红母液（）、氰氯苯腙母液（）、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考储备液（）、木犀草素、槲皮素、黄芩苷、川陈皮素、芹菜素储备液（）。酰胺醇类药物对化脓隐秘杆菌最小抑菌浓度的测定以化脓隐秘杆菌 为质控菌株，采用微量肉汤稀释法测定氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考对 株化脓隐秘杆菌分离株的最小抑菌浓度（）。用（）培养基将对数生长期的菌液稀释至 作为应用菌液，每株菌每种药物均做个平行试验。最后将 孔板加盖并置于 恒温培养箱内培养，基于文献的判定方法，观察细菌生长状况并记录其最低抑菌浓度（）。引物的设计与合成参照 数据库中收录的相关基因序列设计引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成酰胺醇类耐药基因扩增用引物（、）。具体信息见表。酰胺醇类耐药基因的筛查按照细菌基因组 提取试剂盒说明书提取化脓隐秘杆菌基因组 。以该基因组 为模板，利用表中的引物进行酰胺醇类耐药基因的 扩增，反应体系为：上、下游引物各，模板，无菌去离子水补足至。反应程序为：；，（参照表），共 个循环；。产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统观察结果并保存。将上述 产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果与 数据库中已知序列进行比对，以分析扩增到的目的片段是否为目的基因。种黄酮类化合物对化脓隐秘杆菌 值的李旭领等：化脓隐秘杆菌 和 外排泵抑制剂的筛选测定依据药敏试验和耐药基因筛查结果，分别选择单独携带 基因、基因和同时携带两种基因、不携带两种基因的菌株各株作为试验菌株，以化脓隐秘杆菌 为质控菌株，采用微量肉汤稀释法测定木犀草素、槲皮素、黄芩苷、川陈皮素、芹菜素对各化脓隐秘杆菌分离株的 。表基因的扩增引物信息 基因 核苷酸序列（）退火温度 目的片段 登录号 ：注：正向；反向。：；联合药敏试验对外排泵抑制剂的初步筛选以化脓隐秘杆菌 为质控菌株，试验菌株参考“”项下内容。步骤及判定方法参考 ，采用微量棋盘稀释法测定种黄酮类化合物与种酰胺醇类药物的联合抑菌浓度（，），并计算联合抑菌浓度指数（，）。尼罗红外排试验对外排泵抑制剂的筛选参照王迪 的试验方法，首先测定尼罗红的最适浓度，浓度设置为 ，共 个梯度，将化脓隐秘杆菌菌液处理之后，转移至 孔黑板中，用多功能酶标仪检测荧光强度，激发波长为 ，发射波长为 ；然后进行 、外排泵外排作用的测定，荧光强度检测 后，加入 葡萄糖后，继续检测 。记录荧光强度 的 变化。再进行 种黄 酮 类 化合物 抑制 、外排泵外排作用的测定，加入尼罗红之前分别向试管中加入终浓度为 的种黄酮类化合物，室温静置 。试验菌株参考“”项下内容。亚抑菌浓度木犀草素消减化脓隐秘杆菌耐药性的检测参照 的试验步骤，加入终浓度为 的木犀草素，测定种酰胺醇类药物对木犀草素作用组和对照组的化脓隐秘杆菌的 值。试验菌株参考“”项下内容。结果化脓隐秘杆菌对酰胺醇类药物的耐药性氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考对 的 均为，对 株化脓隐秘杆菌分离株的 范围为 。在 株化脓隐秘杆菌中，株菌对所有检测的药物均敏感，株菌对酰胺醇类药物产生了不同程度的耐药性，耐药率分别为氯霉素 （）、甲砜霉素 （）、氟苯尼考 （）；除 号菌耐两种药物外，其余 株菌只对种药物耐药。化脓隐秘杆菌酰胺醇类耐药基因携带情况耐药基因筛查结果（图）显示，化脓隐秘杆菌分离株中耐药基因检出率由高到低分别为 （）、（）、（）、（）、（）、（），未 检 出 、基因。动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）图 株化脓隐秘杆菌中酰胺醇类耐药基因的检出率 .种黄酮类化合物对化脓隐秘杆菌的体外抗菌活性依据耐药基因筛查结果，分别选择株单独携带 基因、基因和同时携带两种基因、不携 带两种基因的菌株作为试验菌株。结果表明，种黄酮类化合物对试验菌株均具有良好的抗菌效果，其中木犀草素抗菌活性最强（表）。联合药敏试验对外排泵抑制剂的初步筛选结果木犀草素和种酰胺醇类药物联用，对不同菌株均呈现相加作用；槲皮素与氯霉素、甲砜霉素具有相加作用，而黄芩苷只与氟苯尼考有相加作用（均为），且相应的黄酮类化合物和酰胺醇类药物对化脓隐秘杆菌的 各下降倍；川陈皮素和芹菜素对试验菌株均呈现无关作用（图）。以上结果表明，木犀草素与酰胺醇类药物的联合抑菌作用相对较好。尼罗红外排试验对外排泵抑制剂的筛选试验结果 、外排泵外排作用的测定结果尼罗红的最适浓度为 （图）。加入葡萄糖后，单独携带和同时携带排基因 和 的菌株荧光强度均有大幅度下降，而不携带外排基因的菌株荧光强度基本不变（图），说明化脓隐秘杆菌 、外排泵均可以外排尼罗红。表种黄酮类化合物对化脓隐秘杆菌的 测定结果 .黄酮类化合物（）不携带两种基因的菌株 单独携带 基因的菌株 单独携带 基因的菌株 同时携带两种基因的菌株 质控菌 木犀草素 槲皮素 黄芩苷 川陈皮素 芹菜素 图种黄酮类化合物与酰胺醇类药物联合抑菌试验结果 李旭领等：化脓隐秘杆菌 和 外排泵抑制剂的筛选图尼罗红最适浓度 种黄酮类化合物抑制 、外排泵外排作用的测定结果加入葡萄糖后，添加了种黄酮类化合物的试验组中，携带 和 基因（单独或同时）的菌株荧光强度的下降幅度均有所缓解，其中以木犀草素作用后的菌株的荧光强度下降最少，而不携带外排基因的菌株荧光强度基本不变（图）。说明这种黄酮类化合物均可以抑制 、外排泵对尼罗红的外排，其中木犀草素的外排抑制作用最强。木犀草素对化脓隐秘杆菌酰胺醇类药物耐药性的消减作用 木犀草素作用化脓隐秘杆菌 后，种药物对不携带个外排基因的试验菌株的抗菌活性无变化，对携带 和 基因（单独或同时）的菌株的 均有不同程度的下降。其中，氯霉素对株菌的 下降了倍，甲砜霉素对株菌的 下降了倍，氟苯尼考对株菌的 下降了倍，氟苯尼考还对株菌的 下降了倍。图化脓隐秘杆菌外排尼罗红作用的比较 .同时携带两个外排基因的菌株；只携带 基因的菌株；只携带 基因的菌株；不携带外排基因的菌株 ；图种黄酮类化合物对化脓隐秘杆菌外排尼罗红的抑制作用 .动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）讨论外排泵的外排作用可介导细菌对抗菌药物的耐药性。与酰胺醇类药物耐药性相关的外排基因在大肠埃希氏菌（、），、沙门氏菌（、）、鲍曼不动杆菌（、）、肺炎克雷伯氏菌（、）、肠球菌（、）、弯 曲 杆 菌（）、鸭 疫 里 默 氏 菌（）、葡 萄 球 菌（）、化 脓 隐 秘 杆 菌（）、胸膜肺炎放线杆菌（）、副猪嗜血杆菌（）等中已有报道。本研究显示，在 株化脓隐秘杆菌中，和 的携带率较高（分别为 、），且携带这两个外排基因的分离株对酰胺醇类药物呈现不同程度的耐药性，说明在化脓隐秘杆菌中此基因型与耐药表型高度相关。外排泵抑制剂的研究已较为广泛。据报道，维拉帕米可抑制结核分支杆菌的外排泵，降低各种抗分支杆菌药物的 ；利血平可抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（）外排泵 ，降低四环素对 的 ；小 檗 碱 可 以 与 外 排 泵 和 相结合，从而抑制 的生长；中药有效成分可抑制大肠埃希氏菌外排泵 ，对大肠埃希氏菌有抗菌增敏作用 。有学者总结发现，白藜芦醇、芍药苷等几种中药提取物均可以抑制细菌外排泵而消减其耐药性；还有研究表明，外排泵抑制剂与抗菌药物联用后可以恢复细菌敏感性，逆转外排泵介导的耐药性 。本研究显示，种黄酮类化合物对化脓隐秘杆菌不仅有良好的抗菌效果，还有外排抑制作用；其中，木犀草素在联合抑菌试验和尼罗红外排试验中作用较为显著，且可以逆转细菌耐药性，从而确定了木犀草素为效果较好的化脓隐秘杆菌 和 外排泵抑制剂。本课题组将继续开展木犀草素抑制 和 外排作用机制的探索研究，以期为天然外排泵抑制剂的开发利用奠定坚实的理论基础。参考文献：，（）：，（）：钟巧贤，袁淑英，梁秋燕，等 屠宰场分离大肠埃希氏菌 ：药敏试验及耐药基因分析动物医学进展，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：（），（）：赵凤菊，关淼，李清竹，等 猪源大肠埃希菌氯霉素类抗生素主要耐药基因的检测与分析动物医学进展，（）：，（）：，（）：，（）：李旭领等：化脓隐秘杆菌 和 外排泵抑制剂的筛选 伊思达，高懿，陈丽，等猪源粪肠球菌对常用抗菌药物的耐药性分析及其酰胺醇类耐药基因的检测 畜牧与兽医，（）：黄雨婷，杨华，周炜，等 至 年浙江省动物源细菌耐药性监测进展畜牧与兽医，（）：关椿久，朱寅初，郑雪，等鸭疫里默氏杆菌耐药现状及耐药机制研究进展 中国家禽，（）：赵素君，曹冶，谢晶，等奶牛源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及氟苯尼考耐药基因 的克隆 动物医学进 展，（）：，：，（）：王庆云安阳地区副猪嗜血杆菌分离株的耐药性与耐药基因检测 动物医学进展，（）：顾觉奋外排泵抑制剂研究进展国外医药（抗生素分册），（）：贾泽，王春光，张石磊，等赤芍水提物及芍药苷对大肠杆菌抗菌增敏活性的影响中国兽医学报，（）：张鹏，王春光，张子闯，等甘草酸对多重耐药大肠杆菌的抗菌增敏作用 畜牧兽医学报，（）：王雅丽，张灵枝，李志君，等动物源大肠埃希氏菌耐药机制及中药对其耐药性消减的研究进展 动物医学进展，（）：李志君，张灵枝，王雅丽，等中药对金黄色葡萄球菌耐药性消除效果的研究现状 动物医学进展，（）：陈宇微，高琛，杨志远，等 种抗菌药物抗大肠埃希氏菌的增效剂筛选试验 动物医学进展，（）：，（.，；.，）：，（.），.，.：；动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）