山羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响.pdf
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1、Vol.50 No.1Journal of Southwest Minzu University(Natural Science Edition)第50 卷第1期Jan.20242024年1月西南民族大自然科学版)doi:10.11920/xnmdzk.2024.01.004山羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响李志斌1,2,3,许晴1,2,3,李瑞文4,5,王永1,2 3,李艳艳1-2.3,朱江江1,2,3,王友利1,2.3,林亚秋1,2 3(1.西南民族大学畜牧兽医学院,四川成都6 10 0 41;2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室,四川成都6 10 0 41
2、;3.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都6 10 0 41;4.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院,四川成都610041;5.成都市妇女儿童中心医院,四川成都610041)摘要:旨在克隆山羊KLF8基因序列,阐明组织表达特性,并初步揭示过表达KLF8后对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的潜在影响.利用逆转录PCR(r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n-p o l y me r a s e c h a i n r e a c t i o n,RT-PCR)方法克隆获得山羊KLF8基因启动子和CDS区序列(coding sequence,CD
3、 S),并运用生物信息学方法分析其序列特征;利用基因重组方法构建山羊pcDNA3.1-KLF8真核过表达载体,利用CCK-8、Ed U 检测方法和实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR,qPCR)明确KLF8对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响.结果显示,获得包含2 个潜在的核心启动子、多个TATA-Box和GATA-Box的山羊KLF8基因启动子2 0 0 1bp和包含KLF家族典型的锌指结构域、发挥转录抑制/激活基序的CDS序列10 6 2bp.KLF8高表达于山羊脾脏组织,极显著高于其他组织(P0.01),中度表达于肾脏和肺脏组织,低表达于背最长肌和股二头肌.过
4、表达KLF8抑制山羊肌内前体脂肪细胞增殖,并且这种作用可能是通过上调CCND1的表达来实现的.结果为明确山羊KLF8基因生物学特征及对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响提供重要的数据支撑。关键词:山羊;KLF8;序列特征;肌内前体脂肪细胞;细胞增殖中图分类号:S827文献标志码:A文章编号:2 0 95-42 7 1(2 0 2 4)0 1-0 0 2 8-11Biological characteristics of KLF8 and its effect onintramuscular preadipocyte proliferation in goatsLI Zhi-bin 2,3,3,XU
5、 Qing.l.2.3,3,LI Rui-wen4.5,WANG Yong1,2,3,LI Yan-yan.2.3,ZHU Jiang-jiangng.2.,WANG You-lil-2,LIN Ya-qul-2.(1.School of Animal and Veterinary Sciences,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China;2.Key Laboratoryof Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization,Minist
6、ry of Education,Chengdu 610041,China;3.Sichuan Provincial Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization,Chengdu 610041,China;4.Women and Childrens Hospital Affiliated to School of Medicine of University of Electronic Science andTechnology,Chengdu 61004
7、1,China;5.Chengdu Women and Childrens Central Hospital,Chengdu 610041,China)Abstract:This experiment aimed to clone goat KLF8 gene sequence,elucidate its tissue expression characteristics,and revealthe potential effect of KLF8 on goat intramuscular preadipocytes proliferation through overexpression
8、technique.The promoterand CDS region sequence of goat KLF8 gene was cloned by RT-PCR technique,along with bioinformatics analysis ofsequence.pcDNA3.1-KLF8 overexpression vector was constructed by gene recombination method.CCK-8,EdU and real-timequantitative PCR(qPCR)were used to clarify the expressi
9、on pattern of KLF8 in the proliferation of goat intramuscular preadipo-cytes and its effect on proliferation.The results showed that the obtained goat KLF8 gene promoter sequence was 2 001bp in收稿日期:2 0 2 3-0 5-0 6通信作者:林亚秋(197 6-),女,教授,博士,研究方向:动物遗传育种与繁殖.E-mail:l i n y q 1999 16 3.c o m基金项目:国家自然科学基金(3
10、2 0 7 2 7 2 3,3190 2 154);四川省应用基础研究计划重点项目(2 0 2 2 JDTD0030);西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(2 0 2 10 57)29期第李志斌,羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响length,containing two potential core promoters,multiple TATA-boxes and GATA-boxes,and 1 062 bp of CDS sequence contai-ning typical zinc-finger domain of KLF family and tra
11、nscriptional repressor/activation motifs.Tissue expression profile assayfound that KLF8 was expressed at a high level in spleen tissue and significantly higher than any other tissues(P 0.01),at amedium level in kidney and lung tissue,at a low level in longissimus dorsi muscle and biceps femoris musc
12、le.Overexpression ofgoat KLF8 inhibited the proliferation of intramuscular preadipocytes,and this regulation may be achieved mainly through up-reg-ulating the expression of CCND1.The results provided important data support to clarify the biological characteristics of goatKLF8 gene and its effect mec
13、hanism on the proliferation of goat intramuscular preadipocytes.Keywords:goat;KLF8;sequence feature;intramuscular preadipocytes;cell proliferation近年来,因居民膳食结构的改变、肉类价格的变动和居民消费习惯的变化等综合作用,羊肉凭借其高蛋白低脂肪的特点备受青睐,我国羊肉消费量持续升高.这对畜牧工作者在羊肉品质培育方向提出了新要求,即在提高产量的同时也要提高肉质品质.肌内脂肪含量是影响畜禽肉质品质的重要因素之一,并以“大理石花纹”呈现.脂质沉积直接影响肌
14、内脂肪含量,然而,产肉动物的脂肪沉积涉及到一系列的生物学过程,如前体脂肪细胞的分化和增殖,而这些生物学过程受到多种转录因子的调控2-3.其中细胞增殖是细胞的一项重要生理过程,是个体生长、发育和遗传的基础,涉及到许多分子、通路等的相互作用.筛选调控脂肪细胞增殖的关键因子对提高肌内脂肪含量和改良羊肉品质具有重要的意义Kruppel样转录因子(Kruppel-likefactor,KLF)家族属于转录调节因子家族,在细胞、组织和全身水平的代谢控制中起着多种重要作用,并控制一系列的生物过程,例如能量稳态、衰老、细胞增殖、分化和调亡等生物过程46 .KLF8是KLF家族成员之一,又被称为BKLF3或ZN
15、F74,其转录受粘着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)、K L F1和KLF3的调控,转录后翻译的主要修饰方式为泛素化7 .KLF8在各组织器官中广泛表达,因此具有多种生物学功能,研究发现KLF8通过调控细胞增殖、迁移、浸润等过程在癌症、肿瘤和心血管疾病中发挥重要的作用8-9,然而最显著的功能是调控各类癌细胞,KLF8参与人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭,人乳腺瘤细胞的侵袭和转移10-1.此外,许多癌细胞经历了过度的内源性脂肪酸生物合成,脂质过度代谢为癌细胞的增殖和迁移提供了物质基础12 .山羊是重要的经济家畜,就其肉用性能而言,脂肪组织的含量对肉质品质至关重要.脂肪组织的生成过
16、程主要包括脂肪细胞数量的增多和甘油三酯的积累而导致的脂肪细胞的体积增大13.本实验室前期发现KLF8调控山羊肌内前体脂肪细胞分化,然而,KLF8是否参与调控山羊肌内前体脂肪细胞增殖并影响脂肪沉积而最终调控山羊肉质品质尚不清楚.因此,为探究KLF8在山羊肌内前体脂肪细胞增殖中的调控作用,本研究以简州大耳羊为研究对象,克隆KLF8的启动子区域和CDS区域;然后对其序列进行生物信息学分析;利用qPCR技术检测其在山羊各组织中的表达情况;利用脂质体转染法将KLF8真核表达载体转人山羊肌内前体脂肪细胞使其过表达,利用CCK-8及EdU方法并结合qPCR技术检测细胞增殖相关基因的表达变化,最终明确KLF8
17、对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响.1材料与方法1.1试验动物及组织样品采集试验动物为6 只2 周岁简州大耳公羊(四川天地羊生物工程有限责任公司),试验动物禁食2 4h后于清晨屠宰,屠宰后迅速采集心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、臂三头肌和股二头肌,DEPC水清洗后将各个组织样品用锡箔纸包裹并放人冻存管,置于液氮中保存备用.山羊肌内前体脂肪细胞由实验室前期试验分离获得。1.2主要试剂TRIzol 试剂和 TB Green TM Premix Ex Taq TM II购自TaKaRa公司;限制性内切酶(KpnI、No t I)、Re v e r-tAid First Stand cDNA Synthe
18、sis Kit购自Thermo公司;Cell CountingKit-8、Ed U 试剂盒购自上海碧云天公司;DMEM/F12培养基、胰蛋白酶和双抗购自Hyclone公司;胎牛血清购自Gemini公司;pMD-19T载体、30第50 卷西南民族大自然科学版)DH5感受态细胞、DNA纯化回收试剂盒、pClone007购自擎科公司;血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、2 GC-richPCRMasterMix购自Tiangen公司;Opti-MEM、L i p o f e c t a mi n e T M 30 0 0 T r a n s f e c t i o n Re a g e n t购
19、自Invitrogen公司.1.3山羊KLF8启动子和CDS区克隆及序列分析1.3.1KLF8启动子克隆取适量山羊臂三头肌放入研钵中,加入液氮进行研磨,用适量PBS重悬样品,超声波短暂破碎,制备成细胞悬液,按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作,提取基因组DNA.根据NCBI上提供KLF8基因组序列(NW_017189516.1:25051547-25053547),利用SnapGene设计KLF8promoter克隆引物(表1).PCR反应体系为2 5L,将PCR产物在1%凝胶电泳中检测后使用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段,将纯化的目的片段连接于pClone007载体,转化
20、至DH5感受态细胞,37 过夜培养,挑取阳性菌落进行PCR鉴定,最后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序.表1克隆引物序列信息Table 1 The sequences information of clone primers引物名称序列信息(5-3)退火温度()克隆区域KLF8-PSGAAGCCTTGGGACTCAGCAG68PromoterKLF8-PAGGAAAAGAATCAAGGGAAAGACAKLF8-KSCACCTCCATTCCTACCCTGATC58CDSKLF8-KACCAGTCAGCTCTTCTAGTG3.1-8SCGGGGTACCATGGATGAACTCATAAACAACT
21、60KLF83.1-8AATAAGAATGCGGCCGCTTACACGGTGTCATGGCGC(Note:S:sense primer;A:antisense primer;KLF8-PS/A:KLF8 promoter cloning;KLF8-KS/A:KLF8 CDS cloning;3.1-8S/A:KLF8 subclone)1.3.2KLF8CDS区克隆用TRizol法提取分化Oh的山羊肌内前体脂肪细胞中的RNA,随后取1g总RNA参照RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录.根据NCBI上提供的KLF8预测序列(XM0275
22、34127.1),利用SnapGene设计KLF8克隆引物(表1),以山羊肌内前体脂肪细胞cDNA为模板进行RT-PCR扩增.通过1%凝胶电泳筛选目的条带,经DNA纯化回收试剂盒纯化后将目的片段连接至pMD-19T载体(16 连接2 h),转化及Amp抗性筛选后进行鉴定,最后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序,将测序正确的菌液提取质粒并保存,质粒命名为pMD-19T-KLF8.1.3.3序列分析对测序获得的山羊KLF8基因启动子和CDS区片段进行生物信息学分析,分析内容及工具见表2.1.4山羊KLF8组织表达特性根据克隆得到的山羊KLF8CDS区序列设计定量引物,以UXT基因作为内参基因14
23、(表3),以山羊各组织cDNA为模板,构建KLF8组织表达谱,qPCR反应体系:TB Green TMPremixEx TaqTMI10L,10molL上、下游引物各1L,组织cDNA1L,ddH,07L,每组设置3个重复.qPCR反应条件:95预变性3min;95变性30 s,Tm退火15s,72延伸2 min,共38 个循环.表2 分析内容及相应分析工具Table 2Analytical contenets and the corresponding ananlysis tools在线工具分析内容Online toolsAnalyticalcontentsBDGPPrediction of
24、 core promoter region in promoterPrediction of transcription factor binding sites inAlibaba2.1promotersEMBOSS CpgplotPromoter CpG island predictionPrediction of promoter TATA Box,CAAT Box andNARODNABankGATA BoxAmino acid translation and comparison of KLF8 cD-BioEdit 7.0.5NAsequenceNCBIAnalysis of co
25、nserved domain of KLF8 proteinSOPMAProtein secondary structure predictionSwissModelPrediction of protein tertiary structureProSA-webTheoretical model of KLF8 proteinSTRINGAnalysis of proteininteraction1.5山羊KLF8过表达载体构建根据KLF8基因CDS区10 6 2 bp的序列和pcD-NA-3.1载体,设计亚克隆引物3.1-8 S/A(表1)并选期31第李志斌KLF8生物学特征及对肌内前体脂
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