生防菌ZF510的分离鉴定及其对白菜细菌性软腐病的防治效果研究.pdf
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1、40(1)146-156 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 2 月 收稿日期:2023-10-13 基金项目:北京设施蔬菜创新团队项目(BAIC01-2023-16);国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25);中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-ASTIP-IVFCAAS);农业农村部园艺作物生物学与种质创制重点实验室 作者简介:*共同第一作者,覃诗扬,硕士研究生,E-mail:;陆凌晨,中级农艺师,E-mail:;*通信作者,李磊,副研究员,E-mail:;李宝聚,研究员,E-mail:。DOI:10.1640
2、9/ki.2095-039x.2024.02.003 生防菌ZF510的分离鉴定及其对白菜细菌性软腐病的 防治效果研究 覃诗扬1,2*,陆凌晨3*,谢学文2,石延霞2,柴阿丽2,王远宏1,李宝聚2*,李 磊2*(1.天津农学院,天津 300384;2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所/蔬菜生物育种全国重点实验室,北京 100081;3.北京市顺义区农业技术 综合服务中心,北京 101300)摘要:白菜软腐病是由巴西果胶杆菌 Pectobacterium brasiliense 引起的一种危害严重的细菌性病害。目前,针对蔬菜细菌性软腐病高效防治的产品较少。为了筛选对白菜细菌性软腐病具有良好拮抗效果的
3、生防细菌,本研究从白菜根际土壤中分离到一株对细菌性软腐病菌具有显著拮抗效果的生防细菌 ZF510。经过形态学特征观察、生理生化特征和多基因系统发育树分析,并通过盆栽试验验证拮抗菌株对白菜细菌性软腐病的防治效果。结果表明,菌株 ZF510 为东湖假单胞菌 Pseudomonas donghuensis,在代谢过程中产生蛋白酶,有合成 IAA 能力、嗜铁能力、溶磷能力。通过抑菌谱分析,证明菌株 ZF510 对巴西果胶杆菌、野油菜黄单胞野油菜致病变种等 7 种病原细菌具有显著的拮抗效果。采用二分皿法测定其挥发性物质对立枯丝核菌、黄瓜蔓枯病菌、茄匍柄霉 3 种病原真菌均有抑制效果。盆栽试验结果显示,接
4、种菌株 ZF510 的白菜细菌性软腐病症状明显减轻,防治效果达到 44.56%。综上所述,菌株 ZF510 具有良好的生防潜力和应用前景。关 键 词:东湖假单胞菌;白菜软腐病;巴西果胶杆菌;生物防治 中图分类号:S476 文献标识码:A 文章编号:1005-9261(2024)01-0146-11 Isolation,Identification and Control Effect of Strain ZF510 on Bacterial Soft Rot of Chinese Cabbage QIN Shiyang1,2*,LU Lingchen3*,XIE Xuewen2,SHI Yan
5、xia2,CHAI Ali2,WANG Yuanhong1,LI Baoju2*,LI Lei2*(1.Tianjin Agricultural College,Tianjin 300384,China;2.State Key Laboratory of Vegetable Biobreeding/Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;3.Beijing Shunyi District Agricultural Technology Co
6、mprehensive Service Centre,Beijing 101300,China)Abstract:Soft rot of Chinese cabbage is a serious bacterial disease caused by Pectobacterium brasiliense.Currently,there are few effective products for the control of bacterial soft rot in vegetables.In order to screen biocontrol bacteria with good ant
7、agonistic effect against Chinese cabbage bacterial soft rot,this study isolated a strain of beneficial bacteria ZF510 from the rhizosphere soil of cabbage.Through morphological observation,physiological and biochemical characteristics,and multi-gene phylogenetic tree analysis,as well as pot experime
8、nts to verify the control effect of the antagonistic strain on Chinese cabbage bacterial soft rot.The results showed that the strain ZF510 was Pseudomonas donghuensis,which produced protease during the metabolic process,and had the ability to synthesize IAA,iron-loving and phosphorus-dissolving abil
9、ity.Through the analysis of bacteriostatic spectrum,it was proved that strain ZF510 had significant antagonistic effects on seven pathogenic bacteria such as 第 1 期 覃诗扬等:生防菌 ZF510 的分离鉴定及其对白菜细菌性软腐病的防治效果研究 147 Pectobacterium brasiliensis and Xanthomonas campestris pv.campestris.The dichotomous dish met
10、hod was used to determine that the volatile substances had inhibitory effects on the three pathogenic fungi of Rhizoctonia solani,Didymella bryoniae and Stemphylium solanacearum.The results of pot experiment showed that the symptoms of bacterial soft rot of Chinese cabbage inoculated with strain ZF5
11、10 were significantly reduced,and the control effect reached 44.56%.In summary,strain ZF510 has great potential for biological control and application prospects.Key words:Pseudomonas donghuensis;cabbage soft rot;Pectobacterium brasiliense;biological control 白菜 Brassica rapa ssp.pekinensis 为十字花科芸薹属蔬菜
12、,是我国种植较为广泛的叶菜类蔬菜,喜温暖湿润环境1。白菜细菌性软腐病是由巴西果胶杆菌 Pectobacterium brasiliense 侵染引起的一种危害严重的细菌性病害2,其寄主范围广、发病率高、传播速率快,一旦爆发,药剂防治难以有效缓解病害传播。现阶段该病害的防治措施有化学防治和生物防治,生物防治由于其安全性及高效、经济、环保等优点,已成为研究热点3,但对细菌性软腐病有高效防效的药剂较少。研究发现在细菌性软腐病的生物防治中,放线菌 Streptomyces virginiae F188 发酵液和发酵滤液可以降低魔芋球茎腐烂程度4,贝莱斯芽胞杆菌 Bacillus velezensis
13、B006 菌剂有效减少白菜软腐病的发病程度5,暹罗芽胞杆菌 Bacillus siamensis B31 菌株能够诱导黄瓜植株产生抗病性,抵御病原菌的侵染6,解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens ZF75 有效减轻芹菜软腐病发病程度7。近年来一些假单胞菌已经证明可以产生不同种类的次生代谢物,包括吩嗪类物质、硝吡咯菌素(pyrrolntrin,Prn)、2,4-DAPG(2,4-diacetylphloroglueinol,Phl)等8参与对抗病原体或调控植物防御系统。此外,假单胞菌属细菌能够产生挥发性物质抑制病原微生物生长,调节植物生长,影响微生物次生代谢物的产生、抗生素耐药性
14、9。一些学者用假单胞菌成功防治了番茄青枯病10、白菜炭疽病11、水稻稻瘟病12和小麦全蚀病13等多种植物病害。目前,东湖假单胞菌Pseudomonas donghuensis 在生物防治上应用较少,东湖假单胞菌 HYS 具备强烈的毒杀秀丽隐杆线虫的能力14,基因组分析东湖假单胞菌 P482 发现该菌株主要产生抗生素等衍生物抑制软腐病菌15,东湖假单胞菌 SVBP6 具有广泛抗真菌活性的主要胞外化合物16,东湖假单胞菌 22G5 能显著减轻由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病的发生17,而东湖假单胞菌对细菌性软腐病的防治鲜有报道。本研究从白菜根际土壤中分离土壤根际细菌,以细菌性软腐病为靶标,利用双层培养
15、法筛选出对细菌性软腐病菌具有较强抑菌活性的东湖假单胞菌 ZF510,通过形态特征、生理生化测定、Biolog 测定和多基因系统发育树,确定其分类地位,同时,测定了拮抗菌株对白菜软腐病的防治效果,以期为东湖假单胞菌 ZF510 开发成为防治细菌性软腐病的生防菌剂提供参考。1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 供试菌株 东湖假单胞菌 Pseudomonas donghuensis ZF510 菌株由本课题组 2021 年自主筛选分离获得;病原菌包括野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 Xanthomonas campestris pv.campestris3、丁香假单胞番茄致病变种 Pseudom
16、onas syringae pv.tomato3、密执安棒杆菌密执安亚种 Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis3、西瓜噬酸菌 Acidovorax citrulli3、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种 Clavibacter michiganense subsp.sepedonicum3、巴西果胶杆菌 Pectobacterium brasiliense3以及丁香假单胞菌流泪致病变种 Pseudomonas syringae pv.lachrymans3、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani3、西瓜壳二孢 Ascochyta ci
17、trullina3和茄匍柄霉 Stemphylium solani3,以上菌株均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分离并保存。1.1.2 供试试剂 细菌基因组 DNA 提取试剂盒(DP302,购自北京天根生化科技有限公司),无水乙醇(分析纯)纯度99%,2Taq Master PCR Mix,ddH2O,琼脂糖,TAE 缓冲液,BM5000 DNA Marker。以上试剂均购于北京博迈德基因技术有限公司。1.1.3 供试培养基 Kings B 培养基(KB):蛋白胨 20.0 g,甘油 10.0 mL,MgSO47H2O 1.5 g,K2HPO4 1.5 g,蒸馏水 1000 mL,pH 7.00
18、.2;Nutrient Broth 培养基(NB):蛋白胨 10.0 g,牛肉粉 3.0 g,NaCl 5.0 g,蒸馏水 1000 mL,pH 7.00.2;水琼脂培养基(WA):5.0 g 琼脂,1000 mL 蒸馏水;脱脂牛奶培养基18:148 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 脱脂牛奶 100 mL 加热后,加入 100 mL NA 培养基;NBRIP 无机磷培养基19:Ca3(PO4)2 5 g,葡萄糖 10 g,(NH4)2SO4 0.15 g,KCl26H2O 0.5 g,MgSO47H2O 0.25 g;CAS 培养基20:琼脂 15.0 g,葡萄糖 9.0 g,蛋
19、白胨 4.5 g,牛肉膏 2.7 g,NaCl 4.5 g,铬天青 121 mg,溴代十六烷基三甲铵 145.8 mg,FeCl3 0.054 g,HCl 0.167 mL。1.1.4 供试白菜品种 速生秀绿,购于中蔬种业科技(北京)有限公司。1.1.5 供试药剂 5%中生菌素可湿性粉剂,稀释 500 倍备用。1.2 拮抗菌株的分离、纯化 采集贵州健康白菜植株根际土壤,采用稀释涂布平板法21,将土壤样品进行梯度稀释,取 100 L 稀释浓度为 10-4、10-5、10-6的悬浮液涂布于 KB 固体培养基,28 培养 24 h3。对单菌落进行划线纯化 35 次,待菌落形态稳定后保存备用。1.3
20、拮抗菌株的筛选 采用平板对峙法22对菌株 ZF510 病原细菌抑菌谱进行测定,用微量移液枪吸取病原细菌菌悬液 150 L,加入到装有 150 mL 已灭好菌、温度 50、Kings B 培养基的 250 mL 三角瓶中,摇匀倒入无菌培养皿中,冷却成平板。在平板中央贴上灭菌滤纸片,用微量移液器向 6 mm 无菌滤纸片滴入 5 L 生防菌液,以滴加空白培养基进行空白对照,28 恒温培养 24 h,观察并测量抑菌圈大小,每个菌种重复 3 次,十字交叉法测量抑菌圈直径。1.4 菌株 ZF510 的鉴定 1.4.1 菌株形态特征观察及生理生化指标测定 使用灭菌牙签挑取菌株 ZF510 单菌落于 KB 固
21、体培养基上,28 培养 24 h。菌株形态特征观察和生理生化指标测定参考常见细菌系统鉴定书册23和伯杰氏细菌鉴定手册24。1.4.2 Biolog 测定 挑取 ZF510 单菌落接种至 KB 培养基试管斜面上,28 恒温培养 24 h,使用 BIOLOG GEN试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对其进行唯一碳源利用的测定。1.4.3 菌株 ZF510 多基因系统发育树构建 利用 TIENGEN 细菌基因组 DNA 提取试剂盒,小量提取菌株ZF510 基因组 DNA 为模板,选择 16S rDNA、gyrB、rpoB 和 rpoD 等保守基因进行 PCR 扩增并测序(表 1)。所得 PCR 产物由北
22、京博迈德生物公司进行测序。使用 MEGA 6.0、Sequence Matrix、Seaview4 等软件对测序结果进行分析,构建最大似然法系统进化树,分析其分类地位25。1.4.4 安全性测定26 将菌株 ZF510 菌悬液 5 L 滴加于血平皿中央,菌悬液晾干后于 28 培养 1 d,每处理 3 次重复。观察是否有透明圈生成,若无透明圈,则表示菌株 ZF510 对生物体具有较好的安全性。表 1 构建多基因系统发育树引物信息 Table 1 Primers of phylogenetic tree 基因 Gene 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence 扩
23、增长度 Amplicon length(bp)来源 Source 5-ATYGAAATCGCCAARCG-3 rpoD rpoD-F/rpoD-R 5-CGGTTGATKTCCTTGA-3 1105 bp 27 5-TGGCCGAGAACCAGTTCCGCGT-3 rpoB rpoB-F/rpoB-R 5-CGGCTTCGTCCAGCTTGTTCAG-3 1126 bp 27 5-TGTAAACGACGGCCAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA-3 gyrB gyrB-F/gyrB-R 5-CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA-3 1320 bp
24、 27 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 16S rDNA 27F/1492R 5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 1465 bp 27 1.5 菌株 ZF510 细菌抑菌谱测定 采用双层培养法3测定菌株 ZF510 对 7 种病原细菌抑制效果。将 5 L 浓度为 1108 CFU/mL 的 ZF510 菌悬液滴加在 KB 平板中心,28 培养 48 h 后,在通风橱内吸取 3 mL 氯仿沿玻璃皿缝隙加入熏蒸灭活,第 1 期 覃诗扬等:生防菌 ZF510 的分离鉴定及其对白菜细菌性软腐病的防治效果研究 149 使用 5 mL 含有病原细菌的 WA 培养基作为上层。
25、28 培养 48 h 后测量抑菌圈直径,计算抑菌率,每个处理 3 次重复。抑制率(%)(对照菌落直径-抑菌圈直径)/对照菌落直径100。1.6 菌株 ZF510 挥发性物质抑菌活性测定 取菌株 ZF510 单菌落接种在液体 KB 培养基中,28、转速 180 r/min 振荡培养 24 h,至菌悬液浓度为 1108 CFU/mL。在二分皿中分别加入 KB 培养基和 PDA 培养基,用灭菌牙签蘸取菌株 ZF510 种子液在含 KB 培养基一侧划线,含 PDA 培养基一侧加入 5 mm 病原真菌菌饼,置于 28 培养箱中倒置培养,未加生防菌作为对照27。观察到空白对照病原菌生长至平板边缘处进行调查
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