家兔ANXA1蛋白与猪瘟病毒E2蛋白相互作用并影响其复制的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45，No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202210007家兔 ANXA1 蛋白与猪瘟病毒 E2 蛋白相互作用并影响其复制的研究赵小天1,2，谢利豹3，张柯慧2，马吉飞1*，李永锋2*，仇华吉1,2*(1.天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；3.北京五加和基因科技有限公司，北京 100176)摘要：本研究团队前期研究发现，猪瘟病毒(CSFV)HCLV株E2蛋白结构域I(E2Domain I)是HCLV株适应家兔的关键结构域，Domain I中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔必需氨基酸。为进一步探究HCLV适应家兔的分子机制，本研究提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白分别与CSFV Shimen(SM)株E2蛋白(SM E2)、HCLV株E2蛋白突变体(HCLV E2P108L-T109I)及HCLV株E2蛋白(HCLV E2)共孵育，经SDS-PAGE后通过蛋白质质谱鉴定，结果却意外发现，CSFV SM E2与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后在37 ku左右处多出一条带；质谱分析结果显示其可能为细胞膜蛋白膜联蛋白1(ANXA1)，且与CSFV SM E2蛋白之间可能存在相互作用。为了分析ANXA1在HCLV适应家兔中的作用，将CSFV SM株和HCLV株分别接种家兔，48 h和72 h后分离各组兔外周血单个核淋巴细胞(PBMC)，采用RT-qPCR方法检测基因mRNA的转录水平。结果显示，与对照组相比，家兔在接种SM株和HCLV株后，基因mRNA转录水平均显著(0.05)或者极显著(0.01)下调，且与接种HCLV株的家兔相比，接种SM株家兔中基因mRNA的转录水平极显著(0.001，72 h)或者显著(0.05，48 h)下调，表明接种SM株后的家兔可能通过调控的转录水平抑制SM株的复制。将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞，48 h后收集细胞样品，通过GST pulldown验证ANXA1与CSFV SM E2蛋白的相互作用；将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1 共 转 染 HEK293T 细 胞 作 为 强 毒 实 验 组，将 pCAGGS-Myc-HCLVE2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为弱毒实验组，48 h后采用Co-IP试验验证ANXA1与不同CSFV E2的相互作用。上述结果进一步表明，ANXA1与CSFV SM E2存在相互作用，但其与HCLV E2无相互作用；将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为实验组，采用激光共聚焦显微镜观察发现SME2蛋白和ANXA1蛋白共定位于细胞浆中。将表达ANXA1的重组质粒转染ST细胞，48 h后分别接种CSFV SM株和HCLV株，采用 RT-qPCR检测CSFV基因的拷贝数。结果显示，与转染pCAGGS-Flag的ST细胞相比，接种CSFV SM株的细胞中病毒基因拷贝数极显著上升(0.01)，而接种HCLV株细胞中病毒基因拷贝数无明显变化。表明过表达ANXA1后可以促进CSFV强毒株的复制，但不影响弱毒株的复制。本研究首次证实，家兔脾脏淋巴细胞ANXA1通过与CSFV SM E2蛋白的相互作用促进CSFV的复制，为进一步研究CSFV E2蛋白的功能奠定了基础。关键词：猪瘟病毒；E2蛋白；病毒复制；适应性；家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白膜联蛋白1中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)06-0559-09The rabbit ANXA1 protein interacts with the E2 protein of classicalswine fever virus and affects its replication收稿日期：2022-10-06基金项目：黑龙江省自然科学基金优秀青年项目(YQ2021C037)作者简介：赵小天(1996-)，男，四川绵阳人，硕士研究生，主要从事猪瘟、非洲猪瘟等猪烈性病防控技术研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authorZHAO Xiao-tian1,2,XIE Li-bao3,ZHANG Ke-hui2,MA Ji-fei1*,LI Yong-feng2*,QIU Hua-Ji1,2*(1.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry,College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China;2.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China;3.Beijing Wujiahe Gene Technology Co.,Ltd.,Beijing 100176,China)Abstract:Previous study demonstrated that Domain I on the E2 glycoprotein(E2DomainI)and P108 and T109 in the domain Iare critical for the adaptation of swine fever rabbit attenuated vaccine strain(HCLV)to rabbits.To investigate the adaptationmechanism of HCLV strain to rabbits,this study utilized protein pulldown technique to analyze the interaction between themembrane proteins from rabbit splenic lymphocytes with the CSFV Shimen(SM)strain E2 protein(SM E2),HCLV strain E2mutant protein(HCLV E2P108L-T109I),and HCLV strain E2 protein(HCLV E2).After SDS-PAGE separation,the protein sampleswere identified by mass spectrometry.Unexpectedly,the results showed that after the interaction between CSFV SM E2 and rabbitsplenic lymphocyte membrane proteins,an additional band appeared around 37ku,and mass spectrometry analysis suggested that itmight be membrane-associated protein annexin A1(ANXA1)potentially and interacts with CSFV SM E2 protein.To analyze therole of ANXA1 in HCLV adaptation to rabbits,rabbits were separately inoculated with CSFV SM and HCLV,and peripheralblood mononuclear cell(PBMC)were isolated from each group of rabbits at 48 hours and 72 hours post-inoculation.Thetranscription levels ofmRNA were detected using the RT-qPCR method.The results showed that compared to the controlgroup,the transcription level of ANXA1was significantly(0.05)or extremely significantly(0.01)downregulated inrabbits inoculated with SM and HCLV strains.Moreover,the transcription level ofmRNA in rabbits inoculated with theSM strain was significantly(0.001,72 hours)or extremely significantly(0.05,48 hours)decreased compared to that inrabbits inoculated with the HCLV strain,indicating that rabbits inoculated with the SM strain may suppress SM replication throughthe regulation oftranscription.HKE293T cells were transfected with pCAGGS-Flag-ANXA1 and pCAGGS-Flagrespectively,and cell samples were collected 48 hours later for GST pulldown assay to verify the interaction between ANXA1 andCSFV SM E2 protein.HEK293T cells were co-transfected with pCAGGS-Strep-SME2 plus pCAGGS-Flag-ANXA1 as the highvirulence experimental group,and pCAGGS-Myc-HCLVE2 plus pCAGGS-Flag-ANXA1 as the low virulence experimental group.After 48 hours,Co-IP assay was performed to validate the interaction between ANXA1 and different CSFV E2 proteins.The aboveresults further demonstrated that ANXA1 interacted with CSFV SM E2,while it had no interaction with HCLV E2.HEK293Tcells were co-transfected with pCAGGS-Strep-SME2 and pCAGGS-Flag-ANXA1,and SM E2 protein and ANXA1 protein wereco-localized in the cytoplasm by laser confocal microscope observation.after overexpressing ANXA1 in ST cells,CSFV SM andHCLV strains were separately inoculated,and the copy number of CSFV genes was detected by RT-qPCR.Compared with thepCAGGS-Flag-transfected ST cells,a significant increase(0.01)in the viral gene copy number in cells inoculated with CSFVSM strain,while no significant change was observed in cells inoculated with HCLV strain.This indicates that overexpression ofANXA1 can promote the replication of virulent CSFV strains,but does not affect the replication of low virulent strains.This studyprovides the first evidence that ANXA1 promotes the replication of CSFV through the interaction with CSFV SM E2 protein,which lays the foundation for further investigation into the function of CSFV E2 protein.Key words:classical swine fever virus;E2 protein;virus replication;adaptation;rabbit ANXA1猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由CSF病毒(CSFV)引起猪的一种烈性传染病，其特征为发热、出血、白细胞减少，通常致死率较高1-5，给世界养猪业造成重大经济损失，被世界动物卫生组织(WOAH)列为须申报的疫病名录6，我国将其列为2类动物疫病名录。CSFV为黄病毒科瘟病毒属成员，其基因组为单股正链RNA7。CSFV基因组约为12.3 kb，包含一个大的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码含3 898个氨基酸的多聚蛋白，在宿主及病毒蛋白酶的作用下产生4个结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)8。目前，我国主要采取免疫接种的中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年560措施预防CSF，常用的疫苗为猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV株)9-11。HCLV株为我国学者在20世纪50年代通过将CSFV Shimen株(SM)在兔体内连续传480余代后培育而成12-14，该疫苗株可为各种日龄的猪提供完全免疫保护15。同时，HCLV株在家兔中具有独特的生物学特征，包括能够引起家兔的定型热反应以及能在家兔的脾脏和淋巴组织中复制10。相反，CSFV SM强毒株则不具备这些特征，这是否与家兔体内的宿主蛋白有关值得探究。研究显示，CSFV非翻译区(Untranslated region，UTR)为HCLV株引起家兔定型热反应所必需，且该区决定HCLV株对家兔的适应性16。最近，本研究团队进一步研究显示将CSFV SM与HCLV株的Ems、E1和E2蛋白基因互换构建了一系列嵌合病毒以及包含E2蛋白不同氨基酸位点突变的重组病毒并在家兔体内作了评价。该研究结果显示，以CSFV SM株为骨架，包含HCLV株Ems-E1-E2、Ems-E2和E1-E2的嵌合病毒均可以在家兔的脾脏中复制，表明HCLV株E2蛋白与Ems或E1赋予HCLV株对家兔的适应性，且E2蛋白结构域I(E2DomainI)是HCLV株适应家兔的关键结构域；Domain I中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔所必需氨基酸14。HCLV株对家兔具有独特的适应性，而E2家兔蛋白又是其适应家兔所必需，这提示，E2蛋白可能通过与特定的家兔宿主膜蛋白相互作用从而影响其在家兔体内的复制。因此，有必要筛选和鉴定与HCLV E2蛋白相互作用的宿主膜蛋白。CSFV病毒粒子含3种囊膜糖蛋白Erns、E1及E27。E2是位于病毒粒子表面的主要囊膜糖蛋白，在CSFV感染过程中诱导细胞产生中和抗体13。有许多宿主因子在CSFV复制过程中发挥不同的作用，CSFV可以利用宿主因子促进其的复制，宿主因子也可能通过某种途径抑制CSFV的复制。目前已有很多宿主蛋白抗病毒功能的研究，例如，肌动蛋白(茁-actin)通过与E2蛋白的相互作用影响CSFV的复制和侵入，进而显著抑制病毒复制14。CSFV通过E2蛋白和宿主硫氧还蛋白(Trx2)的相互作用调控Trx2的表达量，从而拮抗Trx2抑制病毒复制的能力15。膜联蛋白2(Annexin 2，ANXA2)与E2蛋白相互作用参与CSFV的侵入16。ANXA1是Ca2+和磷脂结合蛋白家族成员，作为糖皮质激素介导的免疫应答效应器和炎症反应的调节器，在宿主的先天免疫反应中起重要作用，且还有抗炎活性。本团队前期研究发现，家兔脾脏淋巴细胞是HCLV感染家兔的靶细胞，E2P108-T109是HCLV侵入家兔脾脏淋巴细胞并适应家兔的关键氨基酸17。在此基础上，为了进一步探究HCLV适应家兔的分子机制，本研究提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白分别与CSFVShimen(SM)株E2蛋白(SM E2)、HCLV株E2蛋白突变体(HCLV E2P108L-T109I)和HCLV株E2蛋白(HCLV E2)共孵育后，通过蛋白质质谱鉴定与上述不同病毒E2蛋白作用的膜蛋白成分，免疫共沉淀(Co-IP)和GSTpulldown试验对ANXA1与上述不同病毒E2蛋白作用的膜蛋白成分。结果却意外发现与CSFV SM E2蛋白可能存在互作的家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白膜联蛋白1(ANXA1)。为了进一步分析ANXA1是否与HCLV E2蛋白、其突变体及SM E2蛋白存在互作，本研究分别通过免疫共沉淀(Co-IP)和GST pulldown试验鉴定ANXA1与上述不同病毒E2蛋白之间的相互作用。通过在ST细胞中过表达ANXA1并分析其对CSFV复制的影响，为CSFV感染机制的研究提供参考依据，同时为抗CSFV策略的制定提供新的靶标。1材料与方法1.1病毒、质粒及细胞CSFV SM株和HCLV株、重 组 质 粒 pCAGGS-Flag-ANXA1、pCAGGS-Flag、pCAGGS-Flag-SME2、pCAGGS-Flag-HCLVE2P108L-T109I、pCAGGS-Flag-HCLVE2、pCAGGS-Myc、pCAGGS-Strep-SME2、pCAGGS-Myc-HCLVE2、pGEX-6P-1-GST-SME2、pGEX-6P-1-GST 和 pCAGGS-Strep 以 及PK-15、HEK293T和ST细胞均由本实验室保存。1.2主要试剂DMEM培养基、RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素抗生素溶液、胎牛血清、Flag抗体亲和树脂、Strep抗体亲和树脂、Myc抗体亲和树脂、兔源Flag多克隆抗体(pAb)、鼠源GAPDH单克隆抗体(MAb)、鼠源GST MAb、鼠源E2蛋白WH303MAb、鼠源Histone H3 MAb、兔源IgG、鼠源FlagpAb、Alexa Fluor 488驴抗鼠IgG、Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG均购自Sigma-Aldrich公司；IRDye 800CW山羊抗兔和抗鼠IgG均购自LI-COR Bioscience公司；TRIzol试剂、ChamQ SYBR qPCR Master Mix、Probepremix均购自TaKaRa公司；总RNA提取试剂盒购自博日公司；Fastking一步法反转录试剂盒购自天根生赵小天，等.家兔 ANXA1 蛋白与猪瘟病毒 E2 蛋白相互作用并影响其复制的研究第 6 期561化科技(北京)有限公司；X-treme GENE HP转染试剂购自Roche公司；IL-2购自Abcam公司；70 滋m滤膜购自Biosharp公司；兔外周血淋巴细胞分离试剂盒购自灏洋生物制品科技有限责任公司；兔脾脏淋巴细胞分离试剂盒、膜蛋白提取试剂盒和红细胞裂解液均购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。1.3引 物 的 设 计 与 合 成参 照 GenBank 中 兔 源基因序列(NM_001171152.1)采用Primer3Plus设计用于荧光定量PCR(qPCR)扩增的引物及探针；根据文献18合成CSFV86S/CSFV166R引物，用于扩增CSFV基因，引物及探针均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成(表1)。1.4家兔脾脏淋巴细胞的分离将无菌摘取的家兔脾脏研磨后经200目的铜网过滤，获得单个淋巴细胞悬液，然后用70 滋m滤膜过滤单细胞悬液，500 g离心7 min，弃上清，加入适量红细胞裂解液，冰上裂解5 min后500 g离心5 min，弃上清。将细胞沉淀用RPMI-1640培养液重悬，使终浓度约为107个细胞/mL；利用试剂盒分离兔脾脏淋巴细胞。1.5家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白的提取通过蔗糖密度梯度离心法提取膜蛋白：将兔脾脏淋巴细胞以预冷的PBS缓冲液洗3次，以含8.5%蔗糖的TEA缓冲液裂解30 min，收集细胞裂解液后将全部液体以1 200 g离心5 min以除去细胞碎片。收集上清液以20 000 g离心1 h，弃上清，并以含8.5%蔗糖的TEA缓冲液重悬沉淀。随后分别加入以20%、32%和40%3个浓度的蔗糖，13 000 g离心3 h。吸取32%40%间的悬浮物，以20 000 g离心2 h脱糖。以PBS重悬沉淀，所得液体即为细胞膜提取物。利用BCA蛋白定量试剂盒测定该蛋白的浓度。1.6与不同CSFV E2蛋白相互作用的家兔脾脏淋巴 细 胞 膜 蛋 白 的 筛 选将 pCAGGS-Flag-SME2、pCAGGS-Flag-HCLVE2P108L-T109I和pCAGGS-Flag-HCLVE2 分别转染HKE293T细胞，48 h后收集细胞样品，加入NP-40裂解液4 裂解30 min；4、10 000 g离心20 min，收集各蛋白样品分别与100 滋L Flag树脂4 翻转偶联8 h，利用1.5中提取的膜蛋白溶液先与偶联Flag树脂的SM E2蛋白孵育后，取上清与偶联Flag树脂的HCLV E2P108L-T109I蛋白共孵育，再取上清与偶联Flag树脂的HCLV E2蛋白共孵育后作为实验组，用于钓取与不同CSFV E2蛋白相互作用的家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白；以与未偶联E2蛋白的Flag树脂共孵育作为阴性对照组，孵育结束后，各组均4 2 000 g离心5 min，PBS洗涤3次后，用80 滋L PBS重悬，再加入5伊loading buffer煮沸10 min，经SDS-PAGE电泳后，切含相应蛋白的胶后由华大基因进行质谱分析。1.7感染CSFV家兔体内基因mRNA转录水平的检测将9只14周龄健康新西兰白兔随机分为A、B和C组，每组3只。A、B组分别通过耳缘静脉接种104TCID50CSFV SM株和HCLV株，C组接种1 mLDMEM。分别在接种后48 h和72 h采集各组家兔的外周血，利用兔外周血淋巴细胞分离试剂盒分离兔外周血单个核细胞(PBMC)，提取RNA反转录为cDNA后作为模板，利用表1中的qPCR引物通过qPCR检测CSFV感染家兔PBMC中mRNA的转录水平。1.8ANXA1与CSFV SM E2相互作用的GST pull-down 验 证将 构 建 携 带 GST 标 签 的 SM E2 质 粒pGEX-6P-1-GST-SME2 和 携 带 GST 标 签 的 空 载 体pGEX-6P-1-GST分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导后获得蛋白GST-SM E2和GST-Ev(阴性对照)。将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞，48 h后收集细胞样品，加入NP-40细胞裂解液4 裂解30 min后 4、10 000 g离心20 min，取上清各600 滋L分别加入GST-SM E2和GST-Ev各300 滋L，混匀后取100 滋L留作Input样品，剩余800 滋L加入GST树脂，于4 翻转孵育4 h后作为pulldown样品，上述样品均于4、2 500 g离心5 min弃上清，PBS洗沉淀3次，再用80 滋L PBS重悬，加入5伊loading buffer煮沸5 min，经SDS-PAGE电泳后，分别以鼠源GST MAb(1颐1 000)、兔源Flag pAb(1颐1 000)及鼠源GAPDH MAb(1颐1 000)为一抗，IRDye 800CW标记的山羊抗兔IgG(1颐10 000)、IRDye 800CW标记的山羊抗鼠IgG(1颐10 000)为二抗，利用western blot验证ANXA1与CSFV SM E2的相互作用。表 1本研究所用引物及探针序列引物和探针Primers and probeRT-qPCR-ANXA1-FRT-qPCR-ANXA1-RProbe CSFVv111-FAMCSFV86SCSFV166R序列(5-3)Sequence(5-3)AAAACCCCAGCCCAGTTTGACGAGTTCCAGCACCCTTCATAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGGAACTGGGCTAGCCATGACTGTCCTGTACTCAGGAC中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年562赵小天，等.家兔 ANXA1 蛋白与猪瘟病毒 E2 蛋白相互作用并影响其复制的研究第 6 期5631.9ANXA1与不同CSFV E2相互作用的Co-IP验证将HEK293T细胞铺至6孔细胞培养板中，待细胞汇合度达70%左右，将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为强毒实验组，将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag、pCAGGS-Strep+pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Strep+pCAGGS-Flag分别转染HEK293T细胞作为强毒对照组。将pCAGGS-Myc-HCLVE2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为弱毒实验组，将pCAGGS-Myc+pCAGGS-Flag-ANXA1、pCAGGS-Myc-HCLVE2+pCAGGS-Flag、pCAGGS-Flag+pCAGGS-Myc分别转染HEK293T细胞作为弱毒对照组。转染48 h后加入NP-40细胞裂解液，4 裂解30 min；以4、12 000 g离心20 min，收集上清蛋白样品。强毒组和弱毒组分别取80 滋L作为Input样品，强毒组剩余样品与Strep抗体亲和树脂4 翻转感作8 h作为IP样品，弱毒组剩余样品与Myc抗体亲和树脂4 翻转感作8 h作为IP样品，然后均经PBS洗抗体亲和树脂，4 翻转5 min，500 g离心5 min，共洗6次，最后一次离心结束后，加入80 滋L PBS重悬树脂，加入20 滋L 5伊Loading Buffer煮沸10 min。上述强弱毒样品经SDS-PAGE电泳后，分别以鼠源E2蛋白WH303 MAb(1颐1 000)、兔源FlagpAb(1颐1 000)、兔源Myc pAb(1颐1 000)、鼠源GAPDHMAb(1颐1 000)、Histone H3 MAb(作为内参)(1颐1 000)为一抗，IRDye 800CW标记的山羊抗兔IgG(1颐10 000)、IRDye 800CW标记的山羊抗鼠IgG(1颐10 000)为二抗，利用western blot验证ANXA1与不同CSFV E2的相互作用。1.10ANXA1与CSFV SM E2共定位的激光共聚焦试验将HEK293T细胞铺至激光共聚焦细胞培养皿中，待细胞汇合度达50%左右，将pCAGGS-Strep-SM-E2+pCAGGS-Flag-ANXA1共 转 染 HEK293T 细 胞作 为 实 验 组，pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag、pCAGGS-Flag-ANXA1+pCAGGS-Strep、pCAGGS-Flag+pCAGGS-Strep分别转染HEK293T细胞作为对照组。转染24 h后，经4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，加入0.1%Triton X-100溶液室温透膜15 min，分别以鼠源Flag pAb(1颐500)和兔源E2 pAb(1颐200)为一抗，以Alexa Fluor 488 驴抗鼠IgG(1颐500)和Alexa Fluor594驴抗兔IgG(1颐500)为二抗，经DAPI(1颐1 000)室温染核10 min后，于激光共聚焦显微镜观察SM E2与ANXA1在细胞内的共定位。1.11过表达ANXA1后的ST细胞中CSFV复制能力的检测将ST细胞以每2伊105个/孔铺于24孔细胞培养板中，利用X-treme GENE HP转染试剂分别将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag质粒转染ST细胞，分别作为 实验 组(ST-ANXA1)和 阴性对 照组(ST-Ev)。37 5%CO2培养48 h，再以MOI 0.01分别接种CSFV SM株和HCLV株，继续培养48 h后收获细胞，以TRIzol裂解细胞后提取细胞总RNA，反转录为cDNA后作为模板，采用CSFV86S/CSFV166R引物检测CSFV基因的拷贝数25。2结果2.1与不同CSFV E2蛋白相互作用的家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白的筛选结果采用蔗糖密度梯度离心法提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白，纯化后经BCA蛋白定量试剂盒测浓度为1.9 mg/mL。将Flag标签标记的CSFV SM E2、HCLV E2P108L-T109和HCLV E2分别偶联到Flag树脂上，再分别与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白溶液共孵育12 h后，经SDS-PAGE电泳后由华大基因对切胶样品中的蛋白进行质谱分析。SDS-PAGE及质谱分析结果显示，Flag标签标记的CSFV SM E2蛋白与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后在37 ku左右的条带中 含有多种多肽成分，而 HCLV E2P108L-T109I及HCLV E2与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后也有条带但并不特异(图1)，采用Progenesis QI软件统计分析结果显示，与ANXA1相符的特异性肽段数值为17，肽段覆盖率为59.25%，表明该条带可能是家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白ANXA1，且CSFV SM E2与该蛋白存在相互作用。2.2感染CSFV家兔体内基因mRNA转录水平的检测结果3组新西兰白兔分别在接种后48 h和72 h采集各组家兔的外周血，分离PBMC，采用RT-qPCR方法检测基因mRNA转录水平。结果显示，与接种DMEM的对照相比，家兔在感染强毒株和弱毒株48 h和72 h后基因mRNA转录水平均显著(0.05)或者极显著下调(0.001)，且接种强毒株家兔基因mRNA的转录水平极显著(0.001，72 h)或者显著(0.05，48 h)低于接种弱毒株的家兔(图2)，表明家兔通过下调的转录水平抑制强毒株的复制。2.3ANXA1与CSFV SM E2相互作用的GST pull-图3ANXA1与CSFV SM E2相互作用的GST pulldown验证结果GSTWB:Anti-GSTFlag-ANXA1GST-SM E2WB:Anti-FlagFlag-ANXA1GAPDHpGEX-6P-1-GST-SME2pGEX-6P-1-GSTpCAGGS-Flag-ANXA1pCAGGS-Flag+-+-+-+-+-+-+WB:Anti-FlagWB:Anti-GAPDHM：蛋白Marker；1：阴性对照；24：兔脾脏膜蛋白分别与偶联CSFV SM E2、HCLV E2P108L-T109I及HCLV E2共孵育后的结果M:Protein Marker;1:Negative cintrol;2-4:Rabbit splenic lymphocytemembrane proteins that binds to the CSFV SM E2,HCLV E2P108L-T109I,HCLV E2,respectively图1与不同CSFV E2蛋白相互作用的家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白的SDS-PAGE检测结果170ku130ku100ku70ku55ku40ku35ku25ku15kuANXA1M1234*:0.05;*:0.001图2感染不同CSFV家兔体内基因mRNA转录水平的检测结果Hours post-infection(hpi)1.21.00.80.60.40.204872SMHCLVDMEMdown验证结果将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞，48 h后收集细胞样品，裂解取上清分别分为Input和pulldown样品。两份样品均经western blot检测。结果显示，在Input样品中转染pCAGGS-Flag-ANXA1的HKE293T细胞与Flag抗体反应后出现了特异性条带，而转染pCAGGS-Flag空载体的HKE293T细胞中无该特异性条带(图3)，表明ANXA1蛋白在细胞中获得了表达。在pulldown样品中，转染pCAGGS-Flag-ANXA1的HKE293T细胞中，GST-SM E2与Flag抗体反应出现特异性条带，而GST与GST树脂的结合物与Flag抗体反应后无该特异性条带(图3)，表明CSFV SM E2与ANXA1存在特异性的相互作用。2.4ANXA1与不同CSFV E2相互作用的Co-IP验证结果将强毒实验组与强毒对照组分别培养48 h后裂解细胞取上清分别作为Input和IP样品并经westernblot检测。结果显示，在Input样品中转染pCAGGS-Strep-SM E2+pCAGGS-Flag-ANXA1的HKE293T细 胞分别与Flag抗体和WH303 MAb反应后出现特异性条带，表明SM E2和ANXA1在细胞中均获得高效表达。Co-IP 结 果 显 示，pCAGGS-Strep-SM E2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞的裂解物与 Strep抗体亲和树脂的结合物和WH303 MAb反应后出现了特异性条带，表明Strep抗体亲和树脂可以结合Strep标记的SM E2蛋白，且与Flag抗体反应出现特异性条带，而3个对照组质粒共转染HEK293T细胞的裂解物与Strep抗体亲和树脂的结合物与Flag抗体反应后均无该特异性条带(图4A)，进一步表明CSFV SME2和ANXA1存在特异性的相互作用。将弱毒实验组与弱毒对照组分别培养48 h后裂解取上清分别作为Input和IP样品并经western blot检测。结果显示，在Input样品中转染pCAGGS-Myc-HCLVE2和pCAGGS-Flag-ANXA1的HKE293T细胞分别与Myc抗体和Flag抗体反应后IP样品出现特异性条带，表明HCLV E2和ANXA1在细胞中均能高效表达；Co-IP结果显示，pCAGGS-Myc-HCLVE2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞的裂解物与Myc抗体亲和树脂的结合物和WH303 MAb反应