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乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的检测.ppt
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1、乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的检测p一、耐药的有关定义p二、各种耐药检测技术的评价p三、需要重视的几个问题一、耐药的有关定义一、耐药的有关定义 p病毒学突破(病毒学突破()p病毒反跳(病毒反跳()p生化学突破(生化学突破()p基因型耐药(基因型耐药()p表型耐药(表型耐药()p临床耐药(临床耐药()耐药的有关定义耐药的有关定义p 病毒学突破()p指在核苷类药物治疗过程中,患者的血清 水平一度被抑制,但在继续治疗中血清 水平与最低值相比上升或超过个(倍)。耐药的有关定义耐药的有关定义p 病毒反跳(病毒反跳()p指核苷类药物治疗过程中患者的血清指核苷类药物治疗过程中患者的血清 水平一度被抑制,
2、但在继续治疗中血清水平一度被抑制,但在继续治疗中血清 升高至升高至或高于治疗前水平。或高于治疗前水平。耐药的有关定义耐药的有关定义 生化学突破(生化学突破()指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶()水平一度复常,但在继续治疗转移酶()水平一度复常,但在继续治疗中血清水平又再次升高。肝脏生活指标很中血清水平又再次升高。肝脏生活指标很多,但是在此仅指。多,但是在此仅指。耐药的有关定义耐药的有关定义p 基因型耐药()p指基因组中的某些位点发生改变,导致这种药物对的抑制作用下降或消失。这种基因变异与的耐药性有直接因果关系,通过这些变异位点的检测可判断有无耐
3、药性。耐药的有关定义耐药的有关定义 表型耐药(表型耐药()通过体外细胞培养方法,直接测定对某种药物的敏感性,或者在体外直接测定聚合酶的活性,敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药,即表通过体外细胞培养方法,直接测定对某种药物的敏感性,或者在体外直接测定聚合酶的活性,敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药,即表型耐药。型耐药。通常以来评估通常以来评估 倍倍:敏感敏感 在倍在倍:部分耐药部分耐药 倍倍:耐药耐药耐药的有关定义耐药的有关定义p 临床耐药()p指临床出现病毒复制不能被抑制,或复制一度被抑制后又出现 反跳,同时伴有升高,或肝炎复发的其他临床证据。二、各种耐药检测技术及评价二、各种耐药检测
4、技术及评价p病毒学反跳或突破的监测病毒学反跳或突破的监测p基因型耐药监测基因型耐药监测p表型耐药检测表型耐药检测p临床耐药监测临床耐药监测病毒学反跳或突破的监测病毒学反跳或突破的监测基于对血清基于对血清 载量的动态监测载量的动态监测需重视以下三点:需重视以下三点:.载量检测手段的敏感性载量检测手段的敏感性 .检测技术的可靠性和稳定性检测技术的可靠性和稳定性 .监测的间隔时间监测的间隔时间基因型耐药监测基因型耐药监测时机时机非必须非必须不主张常规、广泛应用不主张常规、广泛应用基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异基因型耐药相关变异在多聚酶序列中的位置在多聚酶序列中的位
5、置基因型耐药的主要技术基因型耐药的主要技术p碱基序列分析法碱基序列分析法p 直接测序直接测序p 克隆测序克隆测序p聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术()()p反向杂交分析技术(反向杂交分析技术()p基因芯片技术基因芯片技术 p实时荧光定量技术实时荧光定量技术p 探针定点突变技术探针定点突变技术p 引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术p 熔解曲线法熔解曲线法 p基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱()()直接测序法直接测序法末端末端终终止法止法化学裂解法化学裂解法测测序自序自动动化化使用特异性引物与使用
6、特异性引物与单单链链模板退火,在聚合模板退火,在聚合酶酶作用下作用下进进行延伸反行延伸反应应,用,用终终止,用区分止,用区分长长度度仅仅相差个核苷酸相差个核苷酸的,从而完成的,从而完成测测序的序的方法。方法。用化学用化学试剂试剂在、在、处处特定的裂解片段,特定的裂解片段,产产生一簇各种生一簇各种长长度度的短的短链链,经过经过放射放射自自显显影可直影可直读顺读顺序。序。类类似末端似末端终终止法,所不同的止法,所不同的是用是用荧荧光染料光染料标记标记,计计算机算机自自动读动读出。出。优优点点简简便、迅速、便、迅速、应应用广用广泛。泛。不需不需酶酶促反促反应应,可,可以以对对寡核苷酸寡核苷酸测测序。
7、序。简便、快速、准确可靠。简便、快速、准确可靠。安全、无放射性污染。安全、无放射性污染。模板用量大大减少。模板用量大大减少。测序能力增强。测序能力增强。变异直接测序结果图谱变异直接测序结果图谱直接测序的局限性直接测序的局限性p.设备贵、技术高、耗材、费时。设备贵、技术高、耗材、费时。p.必须有充足目的基因片段。必须有充足目的基因片段。p.突变株比例小于时,由于竞争抑制作用不能被扩增。直突变株比例小于时,由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测接测序法检测 变异变异克隆测序法克隆测序法克隆测序法克隆测序法p优点:优点:p .有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株有助于发现混合株并可大致确定不
8、同序列毒株p 之间的相对比。之间的相对比。p .提高了检测的灵敏度。提高了检测的灵敏度。p局限性:局限性:p .技术难度较高。技术难度较高。p .检测周期更长。检测周期更长。p .检测的费用大大增加。检测的费用大大增加。碱基变异可能导致:碱基变异可能导致:原有位点消失原有位点消失 产生新的位点产生新的位点 识别位点移位识别位点移位 利用错配引物使利用错配引物使 产物中产生产物中产生 特异的酶切位点特异的酶切位点结果结果:酶切片段长、短变化和多、少变化酶切片段长、短变化和多、少变化聚合酶链式反应及限制性片段长度聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术多态性技术()()限制性内切核酸酶的作用限制性
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