§双波长和三波长分光光度法专题培训课件.ppt
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1、2.22.2双波长双波长和三波长分光和三波长分光光度法光度法1基本原理基本原理 对于混浊试样或成分复杂、背景吸收较大的试样,采用对于混浊试样或成分复杂、背景吸收较大的试样,采用对于混浊试样或成分复杂、背景吸收较大的试样,采用对于混浊试样或成分复杂、背景吸收较大的试样,采用经典的分光光度法就难以找到合适的参比溶液来消除其干扰。经典的分光光度法就难以找到合适的参比溶液来消除其干扰。经典的分光光度法就难以找到合适的参比溶液来消除其干扰。经典的分光光度法就难以找到合适的参比溶液来消除其干扰。若采用双波长分光光度法,将若采用双波长分光光度法,将若采用双波长分光光度法,将若采用双波长分光光度法,将22选择
2、在被测组分的最大吸收选择在被测组分的最大吸收选择在被测组分的最大吸收选择在被测组分的最大吸收波长处,波长处,波长处,波长处,11选择在基本无吸收的波长处,这样可以从分析波选择在基本无吸收的波长处,这样可以从分析波选择在基本无吸收的波长处,这样可以从分析波选择在基本无吸收的波长处,这样可以从分析波长的信号中减去参比波长的信号,消除了干扰,大大提高了长的信号中减去参比波长的信号,消除了干扰,大大提高了长的信号中减去参比波长的信号,消除了干扰,大大提高了长的信号中减去参比波长的信号,消除了干扰,大大提高了方法的选择性和灵敏度。方法的选择性和灵敏度。方法的选择性和灵敏度。方法的选择性和灵敏度。(1)(
3、1)单组分的分析单组分的分析单组分的分析单组分的分析 (2)(2)测定波长测定波长测定波长测定波长22和和和和11通常选用被测组分的最大吸收波长和通常选用被测组分的最大吸收波长和通常选用被测组分的最大吸收波长和通常选用被测组分的最大吸收波长和等吸光点波长进行测定。若无等吸光点或等吸光点无法准确等吸光点波长进行测定。若无等吸光点或等吸光点无法准确等吸光点波长进行测定。若无等吸光点或等吸光点无法准确等吸光点波长进行测定。若无等吸光点或等吸光点无法准确确定,可以选用被测组分的最大吸收波长和该组分吸收光谱确定,可以选用被测组分的最大吸收波长和该组分吸收光谱确定,可以选用被测组分的最大吸收波长和该组分吸
4、收光谱确定,可以选用被测组分的最大吸收波长和该组分吸收光谱曲线下端的某一波长作为测定波长。曲线下端的某一波长作为测定波长。曲线下端的某一波长作为测定波长。曲线下端的某一波长作为测定波长。(2)(2)双组分中某一组分的分析双组分中某一组分的分析双组分中某一组分的分析双组分中某一组分的分析 试样中含有试样中含有试样中含有试样中含有A A、B B两组分,组分两组分,组分两组分,组分两组分,组分B B干扰组分干扰组分干扰组分干扰组分A A的测定。若采用的测定。若采用的测定。若采用的测定。若采用双波长分光光度法,可不分离双波长分光光度法,可不分离双波长分光光度法,可不分离双波长分光光度法,可不分离B B
5、而直接测定而直接测定而直接测定而直接测定A A的含量。的含量。的含量。的含量。(a)(a)等吸光度波长法等吸光度波长法等吸光度波长法等吸光度波长法 (b)(b)为了消除干扰组分为了消除干扰组分为了消除干扰组分为了消除干扰组分B B的吸收,分析波长的吸收,分析波长的吸收,分析波长的吸收,分析波长11选择在组分选择在组分选择在组分选择在组分A A的的的的最大吸收峰或它的附近,参比波长最大吸收峰或它的附近,参比波长最大吸收峰或它的附近,参比波长最大吸收峰或它的附近,参比波长22用作图法确定,如下图所用作图法确定,如下图所用作图法确定,如下图所用作图法确定,如下图所示。在组分示。在组分示。在组分示。在
6、组分A A的的的的22处作一垂直于处作一垂直于处作一垂直于处作一垂直于X X坐标的直线,该直线与干扰坐标的直线,该直线与干扰坐标的直线,该直线与干扰坐标的直线,该直线与干扰组分组分组分组分B B相交于某一点,再从这点作平行于相交于某一点,再从这点作平行于相交于某一点,再从这点作平行于相交于某一点,再从这点作平行于X X坐标的直线并与组分坐标的直线并与组分坐标的直线并与组分坐标的直线并与组分B B的吸的吸的吸的吸收曲线相交于一点或几点,与该交点相对应的波长作为参比波收曲线相交于一点或几点,与该交点相对应的波长作为参比波收曲线相交于一点或几点,与该交点相对应的波长作为参比波收曲线相交于一点或几点,
7、与该交点相对应的波长作为参比波长,如图中的长,如图中的长,如图中的长,如图中的 1 1或或或或 1 1。所选择的。所选择的。所选择的。所选择的 2 2和和和和 1 1应符合以下条件:应符合以下条件:应符合以下条件:应符合以下条件:第一,第一,第一,第一,干扰组分在该两波长处的吸光度相同;第二,被测组分在该两干扰组分在该两波长处的吸光度相同;第二,被测组分在该两干扰组分在该两波长处的吸光度相同;第二,被测组分在该两干扰组分在该两波长处的吸光度相同;第二,被测组分在该两波长处的吸光度差波长处的吸光度差波长处的吸光度差波长处的吸光度差A A要足够大。要足够大。要足够大。要足够大。由吸光度加和性知,混
8、合试样由吸光度加和性知,混合试样由吸光度加和性知,混合试样由吸光度加和性知,混合试样在在在在22和和和和11处的吸光度可表示为:处的吸光度可表示为:处的吸光度可表示为:处的吸光度可表示为:双波长分光光度计的输出信号为双波长分光光度计的输出信号为双波长分光光度计的输出信号为双波长分光光度计的输出信号为A A:合并以上三式合并以上三式合并以上三式合并以上三式因因因因所以所以所以所以该式表明,此时测得的该式表明,此时测得的该式表明,此时测得的该式表明,此时测得的 A A与干扰组分无关。与干扰组分无关。与干扰组分无关。与干扰组分无关。(b)系数倍率法系数倍率法系数倍率法系数倍率法 当干扰组分当干扰组分
9、当干扰组分当干扰组分B B的吸收光谱曲线无吸收峰,仅出现陡坡,不的吸收光谱曲线无吸收峰,仅出现陡坡,不的吸收光谱曲线无吸收峰,仅出现陡坡,不的吸收光谱曲线无吸收峰,仅出现陡坡,不存在吸光度相等的两个不同波长,如下图所示。在这种情况下,存在吸光度相等的两个不同波长,如下图所示。在这种情况下,存在吸光度相等的两个不同波长,如下图所示。在这种情况下,存在吸光度相等的两个不同波长,如下图所示。在这种情况下,采用系数倍率法。利用双波长分光光度计本身的电子线路,选采用系数倍率法。利用双波长分光光度计本身的电子线路,选采用系数倍率法。利用双波长分光光度计本身的电子线路,选采用系数倍率法。利用双波长分光光度计
10、本身的电子线路,选择被测组分吸收差值大的波长进行测定。用差分放大器可获得择被测组分吸收差值大的波长进行测定。用差分放大器可获得择被测组分吸收差值大的波长进行测定。用差分放大器可获得择被测组分吸收差值大的波长进行测定。用差分放大器可获得混合试样在波长混合试样在波长混合试样在波长混合试样在波长22和和和和11处的差示信号处的差示信号处的差示信号处的差示信号S S:式中,式中,式中,式中,K2K2和和和和K1K1分别为在分别为在分别为在分别为在22和和和和11处的放大系数;组分处的放大系数;组分处的放大系数;组分处的放大系数;组分A A和和和和B B在在在在22和和和和 1 1处的吸光度分别为处的吸
11、光度分别为处的吸光度分别为处的吸光度分别为 调节仪器中的信号放大调节仪器中的信号放大调节仪器中的信号放大调节仪器中的信号放大器,使干扰组分器,使干扰组分器,使干扰组分器,使干扰组分B B在波长在波长在波长在波长2 2 和和和和11处的信号相等,由此得处的信号相等,由此得处的信号相等,由此得处的信号相等,由此得系数倍率系数倍率系数倍率系数倍率KK为:为:为:为:则上式为:则上式为:则上式为:则上式为:该式表明,干扰组分消除,信号该式表明,干扰组分消除,信号该式表明,干扰组分消除,信号该式表明,干扰组分消除,信号S S与被测组分的吸光度值有关,与被测组分的吸光度值有关,与被测组分的吸光度值有关,与
12、被测组分的吸光度值有关,从而可以测定其含量。从而可以测定其含量。从而可以测定其含量。从而可以测定其含量。2.双波长分光光度计双波长分光光度计 双波长分光光度计采用两个单色器,如图所示。光源的光双波长分光光度计采用两个单色器,如图所示。光源的光双波长分光光度计采用两个单色器,如图所示。光源的光双波长分光光度计采用两个单色器,如图所示。光源的光束经两个单色器后分别产生波长为束经两个单色器后分别产生波长为束经两个单色器后分别产生波长为束经两个单色器后分别产生波长为 1 1和和和和22的两单色光,由切光的两单色光,由切光的两单色光,由切光的两单色光,由切光器使两单色光以一定的时间间隔交替通过同一吸收池
13、,并被光器使两单色光以一定的时间间隔交替通过同一吸收池,并被光器使两单色光以一定的时间间隔交替通过同一吸收池,并被光器使两单色光以一定的时间间隔交替通过同一吸收池,并被光电倍增管交替接收,测得吸光度差电倍增管交替接收,测得吸光度差电倍增管交替接收,测得吸光度差电倍增管交替接收,测得吸光度差 A A。当光强度为。当光强度为。当光强度为。当光强度为IoIo的两单色的两单色的两单色的两单色光光光光11和和和和 2 2交替通过同一吸收池时,根据比耳定律,对交替通过同一吸收池时,根据比耳定律,对交替通过同一吸收池时,根据比耳定律,对交替通过同一吸收池时,根据比耳定律,对11波长:波长:波长:波长:双波长
14、分光光度计光路示意图双波长分光光度计光路示意图1.1.光源,光源,2 2、3.3.两个单色器,两个单色器,4.4.斩光器,斩光器,5 5.样品池,6.光电倍增管。对对对对22波长:波长:波长:波长:式中,式中,式中,式中,As1As1和和和和As2As2为背景吸收,若为背景吸收,若为背景吸收,若为背景吸收,若11和和和和22很相近,可视为相很相近,可视为相很相近,可视为相很相近,可视为相等。因此通过吸收池后的光强度差为:等。因此通过吸收池后的光强度差为:等。因此通过吸收池后的光强度差为:等。因此通过吸收池后的光强度差为:式中,式中,式中,式中,As1As1和和和和As2As2为背景吸收,若为背
15、景吸收,若为背景吸收,若为背景吸收,若11和和和和22很相近,可视为相很相近,可视为相很相近,可视为相很相近,可视为相等。因此通过吸收池后的光强度差为:等。因此通过吸收池后的光强度差为:等。因此通过吸收池后的光强度差为:等。因此通过吸收池后的光强度差为:该式表明,试样溶液中被测组分的浓度与两个波长该式表明,试样溶液中被测组分的浓度与两个波长该式表明,试样溶液中被测组分的浓度与两个波长该式表明,试样溶液中被测组分的浓度与两个波长11和和和和22处的处的处的处的吸光度差吸光度差吸光度差吸光度差 A A成比例,这是双波长法的定量依据。成比例,这是双波长法的定量依据。成比例,这是双波长法的定量依据。成
16、比例,这是双波长法的定量依据。双波长分光光度计既可作为双波长的方式,也可作为单波双波长分光光度计既可作为双波长的方式,也可作为单波双波长分光光度计既可作为双波长的方式,也可作为单波双波长分光光度计既可作为双波长的方式,也可作为单波长双光束的方式工作。长双光束的方式工作。长双光束的方式工作。长双光束的方式工作。双波长光光度计不仅可测定多组分混合试样、混浊试样,双波长光光度计不仅可测定多组分混合试样、混浊试样,双波长光光度计不仅可测定多组分混合试样、混浊试样,双波长光光度计不仅可测定多组分混合试样、混浊试样,而且还可测得导数吸收光谱。测量时使用同一吸收池,不用空而且还可测得导数吸收光谱。测量时使用
17、同一吸收池,不用空而且还可测得导数吸收光谱。测量时使用同一吸收池,不用空而且还可测得导数吸收光谱。测量时使用同一吸收池,不用空白溶液作参比,消除了参比池的不同和制备空白溶液等产生的白溶液作参比,消除了参比池的不同和制备空白溶液等产生的白溶液作参比,消除了参比池的不同和制备空白溶液等产生的白溶液作参比,消除了参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差。此外,使用同一光源来获得两束单色光,减小了由光源误差。此外,使用同一光源来获得两束单色光,减小了由光源误差。此外,使用同一光源来获得两束单色光,减小了由光源误差。此外,使用同一光源来获得两束单色光,减小了由光源电压变化而产生的误差,因此,灵敏度高。电压
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