家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析.pdf

54卷南 方 农 业 学 报 2126家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析张永红1，2，杨大平2，许珍娣3，邵榆岚2，李玲利2，张宏瑞1*（1云南农业大学植物保护学院，云南昆明650201；2云南省农业学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101；3陇川县农业技术推广中心，云南陇川678700）摘要：【目的】了解云南省德宏州陇川县蚕区家蚕核型多角体病毒（BmNPV）株系的遗传地位和多样性，为厘清云南蚕区BmNPV的起源及科学防控家蚕血液型脓病提供参考依据。【方法】对分离自云南省德宏州陇川县蚕区的BmNPV进行lef-8基因克隆，通过ExPASy、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、NetOGlyc 4.0、NetPhos 2.0及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析，并基于lef-8基因核苷酸序列相似性，采用MEGA7.0中的邻接法（NJ）构建系统发育进化树。【结果】云南省德宏州陇川县蚕区BmNPV-YNLC株的lef-8基因序列全长2631 bp，共编码876个氨基酸残基；其编码蛋白（LEF-8）无信号肽序列，也不存在跨膜结构域，蛋白分子量为101.63 kD，理论等电点（pI）为8.8；在第750800位氨基酸残基区域具有较高的疏水性，部分氨基酸位点表现为亲水性，且具有较高抗原指数和表面可及性；存在6个潜在的N-糖基化位点，62个磷酸化位点（25个丝氨酸磷酸化位点，23个苏氨酸酸化位点，14个酪氨酸磷酸化位点），但不存在O-糖基化位点。BmNPV-YNLC株与BmNPV-T3株的lef-8基因核苷酸序列相似性为99.7%，BmNPV-YNLC株lef-8基因在第9698位核苷酸序列上存在3个碱基（CAA）缺失；此外，还存在2个非同义突变（646TA和1895CG）和7个同义突变。基于lef-8基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示，BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近，而与我国流行的BmNPV遗传关系较远。【结论】lef-8基因在不同地区来源的BmNPV株系中高度保守，BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近，但其LEF-8蛋白N端存在氨基酸缺失突变，说明BmNPV-YNLC株为云南蚕区的新流行株系。关键词：家蚕；家蚕核型多角体病毒（BmNPV）；lef-8基因；遗传多样性；系统进化分析中图分类号：S884.51文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）07-2126-09收稿日期：2022-09-14基金项目：国家自然科学基金项目（31960684）；微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室开放课题基金项目（CKMIC202102）通讯作者：张宏瑞（1976-），https:/orcid.org/0000-0002-0089-1099，博士，教授，博士生导师，主要从事昆虫生态与害虫综合防治研究工作，E-mail：第一作者：张永红（1985-），https:/orcid.org/0000-0003-2552-8998，研究方向为家蚕病理学，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（7）：2126-2134ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.07.024Cloning and phylogenetic analysis of lef-8 gene inBombyx morinucleopolyhedrovirusZHANG Yong-hong1，2，YANG Da-ping2，XU Zhen-di3，SHAO Yu-lan2，LI Ling-li2，ZHANG Hong-rui1*（1College of Plant Protection，YunnanAgricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China；2Institute of SericultureandApiculture，YunnanAcademy ofAgricultural Science，Mengzi，Yunnan 661101，China；3LongchuanAgriculturalTechnology Extension Center，Longchuan，Yunnan 678700，China）Abstract：【Objective】This study aimed to understand the genetic diversity of the Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）strains in sericultural regions of Longchuan County，Dehong Prefecture，Yunnan Province，and provide refe-rence for the origin of Yunnan BmNPV and the scientific prevention and control of B.mori nuclear polyhedrosis.【Method】The lef-8 gene of BmNPV isolate from B.mori in the sericultural regions of Longchuan County，Dehong Prefecture，Yun-nan Province was cloned and analyzed based on bioinformatics through online software including ExPASy，SignalP 5.0，TMHMM 2.0，NetOGlyc，NetPhos 2.0 and SWISS-MODEL.Then neighbor-joining（NJ）method of MEGA 7.0 wasapplied to constructa phylogenetic treeon the basis of the similarity of lef-8 gene nucleotide sequence.【Result】The wholelength of lef-8 gene nucleotide sequence of BmNPV-YNLC strain from sericultural regionsof Longchuan County，DehongPrefecture，Yunnan Province was 2631 bp，which encoded 876 amino acid residues.The encoded protein（LEF-8）hadneither signal peptide sequence nor transmembrane domain，with the molecular weight of the protein being 101.63 kD and7期21270引言【研究意义】家蚕血液型脓病是蚕业生产上最常见的病毒病之一，其传染性强、致死率高，若养蚕环境消毒不彻底，极有可能暴发流行而给蚕桑产业带来巨大经济损失（鲁兴萌，2012）。家蚕血液型脓病在我国蚕区普遍发生，云南蚕区平均发病率在5.0%左右，且近年来发病率呈上升趋势，严重的蚕区发病率达到12.8%（白兴荣等，2011）。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）作为血液型脓病的病原微生物，其包涵体蛋白晶体结构稳定，能抵御多种不良环境因素而长时间保持侵染力，广泛存在于在养蚕环境中（唐芬芬等，2015），极易通过各种因素对家蚕造成感染且能远距离传播（Fuxa，2004），给家蚕血液型脓病的防治带来极大挑战。lef-8基因（Late expression factor 8 gene）存在于所有鳞翅目昆虫核型多角体病毒（NPVs）基因组中，适用于研究病毒的系统发育（Herniou et al.，2001；Lange et al.，2004），了解其遗传关系，对开展BmNPV地理遗传结构和遗传多样性研究及家蚕血液型脓病防控均具有重要意义。【前人研究进展】BmNPV是杆状病毒科（Baculoviridae）杆状病毒属（-NPV）的重要成员（Miele et al.，2011），是一种具有核衣壳包裹的DNA病毒，在宿主细胞的细胞核中增殖。BmNPV拥有双链闭合的DNA基因组（Lach-mann et al.，1999），其基因组和功能基因鉴定的相关研究已取得长足进展，且多个基因被应用于开展序列特征和进化分析。齐义鹏等（2000）研究发现BmNPV中国株和日本株的vp39基因同源性达97.5%；Liang等（2013）通过polyhedrin和p10基因对广西蚕区的BmNPV流行株进行遗传进化分析，结果发现广西蚕区分布着不同的BmNPV流行株；Xu等（2013）研究表明，不同地区BmNPV株系基因组中的开放阅读框（ORF）高度同源，且基因片段间存在不同程度的碱基插入或缺失现象；陈朝蓉等（2017）、陈慧珠等（2021）基于gp64基因序列特征的研究表明，广西蚕区不同BmNPV流行株的gp64基因呈现遗传多样性，且序列的插入突变能显示一定地域特点。lef-8基因是BmNPV重要的早期表达基因，能调节晚期基因表达，其编码DNA定向作用于RNA聚合酶的最大亚基（Guarino et al.，1998）。lef-8基因作为BmNPV复制的必须基因（Liu et al.，2022），其编码的LEF-8蛋白包含1个保守基序GXKX4HGQ/NKG，在lef-8基因缺失的BmNPV突变体中病毒不能启动极晚期基因转录或产生感染性粒子（Ono et al.，2012；Ioannidis etal.，2016）。张晓倩（2021）研究表明，敲除lef-8基因可有效抑制BmNPV在家蚕体内的复制，为选育抗家蚕血液型脓病品种提供了新策略。此外，lef-8基因在不同种类的NPV基因组中具有保守性，可作为病毒分子检测和鉴定的依据（付建玉和韩宝瑜，2008；Jose et al.，2013）。Gani等（2021）以lef-8基因作为BmNPV印度株进化分析的核心基因，构建的系统发育进化树提示印度7个地区的BmNPV分离株与本土代表株系BmNPV-India的亲缘关系最近。【本研究切入点】云南省拥有多种地理气候，导致云南蚕区存在诸多BmNPV流行株（Zhang et al.，2019，2021），但至今鲜见针对云南蚕区BmNPV流行株lef-8基因序列多样性及遗传进化的研究报道。【拟解决的关键问题】对分离自云南省陇川县蚕区的BmNPV进行lef-8基因克隆及生物学信息分析，并基于LEF-8氨基酸序列构建系统发育进化树，旨在了解该地区BmNPV株系的遗传地位和多样性，为厘清云南蚕区BmNPV的起源及科学防控家蚕血液型脓病提供参考依据。the theoretical isoelectric point（pI）8.8.The amino acid residues from 750 to 800 showed high hydrophobicity，and someamino acid sites showed hydrophilicity，high antigenic index and surface accessibility.The amino acid sequence of theprotein contained 6 potential N-glycosylation sites and 62 phosphorylation sites（25 serine phosphorylation sites，23 threo-nine phosphorylation sites and 14 tyrosine phosphorylation sites），but did not have O-glycosylation sites.The similarity oflef-8 gene nucleotide sequence from BmNPV-YNLC strain and BmNPV-T3 strain was 99.7%.The lef-8 gene of BmNPV-YNLC strain had three base（CAA）deletionat positions 96-98，and there were two nonsynonymous mutations（646TAand1895CG）and seven synonymous mutations in the nucleotide sequence.The phylogenetic tree constructed via lef-8gene nucleotide sequence similarity suggested that the genetic relationship between BmNPV-YNLC strain and BmNPVfrom Japan and South Korea was close，while that between BmNPV-YNLC strain and BmNPV from China was far.【Con-clusion】The lef-8 gene is highly conserved in BmNPVs strains from different regions.BmNPV-YNLC strain is closelyrelated to BmNPV from Japan and South Korea，but there is amino acid amine deletion and mutation in its LEF-8 proteinN-terminal，which indicates that BmNPV-YNLC is a new popular strainin Yunnan sericultural regions.Key words：Bombyx mori；Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）；lef-8 gene；genetic diversity；phyloge-netic analysisFoundation items：National Natural Science Foundation of China（31960684）；Opening Fund Project of ChongqingKey Laboratory on Microsporidia Infection and Control（CKMIC202102）张永红等：家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析54卷南 方 农 业 学 报 21281材料与方法1.1试验材料病蚕样品采自云南省德宏州陇川县户撒乡铅勒村。T-A克隆（pMD19-T载体）试剂盒（TaKaRa）购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR预混液（2High Fidelity PCR Master Mix）和PCR产物回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。1.2引物设计与合成根据GenBank已公布的BmNPV-Zhejiang株lef-8基因序列设计特异性扩增引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.3病毒粒子收集及其基因组提取采集的病蚕样品用灭菌水研磨并纱布过滤，重复离心收集离心管底部的白色病毒粒子层，置于生物显微镜（Olympus CX33）下观察并拍照。根据UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒操作说明抽提病毒基因组，病毒基因组通过吸附柱洗脱，获得的DNA溶液置于-20 保存备用。1.4lef-8基因片段克隆以抽提的病毒基因组为模板进行PCR扩增，反应体系50.0 L：2高保真PCR Mix预混液25.0 L，上、下游引物（10 mol/L）各2.0 L，病毒基因组模板1.0 L，ddH2O补足至50.0 L。扩增程序：94 预变性3 min；94 30 s，55 30 s，72 1 min，进行35个循环；72 终延伸10 min。PCR扩增产物经回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，以M13引物挑选阳性克隆并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.5生物信息学分析测序结果以BioXM 2.6（http:/ 5.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php/SignalP-5.0）预测蛋白信号肽；通过TMHMM 2.0（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测蛋白跨膜结构（龚竞等，2022）；以NetOGlyc 4.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php/NetO-Glyc-4.0）和NetNGlyc 1.0（http:/www.cbs.dtu.dk/ser-vices/NetNGlyc/）预测O-糖基化和N-糖基化位点；采用NetPhos 2.0（http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测蛋白磷酸化位点；应用DNASTAR预测蛋白亲水性、抗原指数和表面可及性分布情况；运用SWISS-MODEL（https:/swissmodel.expasy.org/）预测蛋白三级结构；基于lef-8基因ORF序列，采用引物名称Primerlef-8-F1lef-8-R1lef-8-F2lef-8-R2lef-8-F3lef-8-R3引物序列Primer sequence5-GTTTGCAATCGTGCAAGCGTTATC-35-CAAATCGCTCATGTCCAAATTG-35-GACACGATCAATTTGGGTAC-35-GTCTCATATATTGCGTATC-35-CAATATTGTTATTGCTGCTG-35-GACATAATTAGTGTGCAATAATC-3扩增产物大小（bp）Amplifiedproduct size1142748974表 1BmNPV lef-8基因扩增引物序列信息Table 1BmNPV lef-8 gene amplification primer sequence in-formation编号Number123456789101112131415161718毒株名称StrainBmNPV-YNLCBmNPV-BaoshanBmNPV-GuangxiBmNPV-ZhejiangBmNPV-CubicBmNPV-C1BmNPV-C2BmNPV-C6BmNPV-T3BmNPV-LaBmNPV-H4BmNPV-IndiaBmNPV-MyBmNPV-BrazilianBomaNPV-S1BomaNPV-S2AcMNP-C6ApNPV-Liaoning宿主Host家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori家蚕 B.mori野桑蚕 B.mandarina野桑蚕 B.mandarina苜蓿尺蠖Autographa californica柞蚕Antheraea pernyiGenBank登录号GenBank IDOP377773.1MT501299.1JQ991011.1JQ991008.1JQ991009.1KF306215.1KF306216.1KF306217.1L33180.1LC500465.1LC150780.1JQ991010.1MW842985.1KJ186100.1FJ882854.1JQ071499.1NC_001623.1NC_008035.3地域来源Geographical origin中国云南省陇川县中国云南省保山市中国广西中国浙江中国江苏韩国韩国韩国日本老挝日本印度印度迈索尔巴西中国江苏中国江苏美国中国辽宁表 2不同地域来源NPVs的lef-8基因序列信息Table 2lef-8 gene sequence information of NPVs from different geographical origins7期2129MEGA 7.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树（Kumar et al.，2015），Bootstrap设为1000次。2结果与分析2.1病蚕样品收集情况采自云南省德宏州陇川县蚕区的病蚕呈现体色乳白、体躯肿胀、节间膜升高等典型病症（图1-A），病蚕体液在光学显微镜下观察发现，病毒多角体呈多面体构象（图1-B）。2.2BmNPV lef-8基因遗传多态性分析结果以从病蚕样品抽提获得的BmNPV基因组为模板，分段克隆lef-8基因，测序结果拼接后进行序列比对，结果表明，云南省陇川县蚕区BmNPV-YNLC株的lef-8基因序列全长2631 bp，共编码876个氨基酸残基；其编码蛋白（LEF-8）无信号肽序列（图2），也不存在跨膜结构域（图3），蛋白分子量为101.63 kD，pI为8.84；LEF-8蛋白在第750800位氨基酸残基区域具有较高的疏水性，部分氨基酸位点表现为亲水性，且具有较高抗原指数和表面可及性（图4），可能是B细胞的识别位点，可作为潜在的抗原用于免疫动物制备抗体。NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0预测结果显示，LEF-8蛋白有6个潜在的N-糖基化位点，但不存在O-糖基化位点；NetPhos 2.0预测发现LEF-8蛋白存在62个磷酸化位点（25个丝氨酸磷酸化位点，23个苏氨酸酸化位点，14个酪氨酸磷酸化位点）。通过比对BmNPV-YNLC株、日本BmNPV-T3株和ApNPV-liaoning株的LEF-8氨基酸序列，发现保守基序GXKX4HGQKG存在于不同来源NPVs的LEF-8蛋白中（图5）。利用SWISS-MODEL对BmNPV-YNLC株LEF-8蛋白进行同源建模，结果发现BmNPV-YNLC株LEF-8蛋白三级结构与BmNPV-T3株LEF-8蛋白具有相同的空间构象（图6），也说明BmNPV-YNLC株lef-8基因N端ATG的缺失突变并未对LEF-8蛋白的空间构象产生影响。由表3可知，BmNPV-YNLC株与国内外BmNPV参考株的lef-8基因核苷酸序列相似性均在99.0%以上，对应的遗传距离为0.0010.010，其中与Bm-NPV-T3株的相似性为99.7%。与BmNPV-T3株相比，BmNPV-YNLC株lef-8基因在第9698位核苷酸序列上存在3个碱基（CAA）缺失（表4），结果导致1个天冬酰胺（Asn）的缺失突变，此现象在BmNPV-C2、Bm-图 1家蚕血液型脓病症状及BmNPV多角体形态特征Fig.1Symptoms of nuclear polyhedrosis and morphological characters of BmNPV polyhedron in B.moriA：感染BmNPV的病蚕；B：光学显微镜下的BmNPV多角体A：Symptoms of diseased B.mori infected with BmNPV；B：An optical microscope scanning of BmNPV polyhedron图 2BmNPV-YNLC株LEF-8蛋白信号肽预测结果Fig.2SignalpeptidepredictionofBmNPV-YNLCstrainLEF-8protein0.80.40.0概率 Probability0204060位置 PositionAB图 3BmNPV-YNLC株LEF-8蛋白跨膜结构域预测结果Fig.3Protein transmembrane domain prediction of BmNPV-YNLC strain LEF-8 protein1.21.00.80.60.40.20.0100200300400500600700800概率 Probability位置 Position张永红等：家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析54卷南 方 农 业 学 报 2130图 4BmNPV-YNLC株LEF-8蛋白亲水性及抗原指数和表面可及性预测结果Fig.4Prediction on hydrophilicity，antigenic index and surface probability of BmNPV-YNLC strain LEF-8 protein图 5BmNPV-YNLC株与BmNPV-T3株及ApNPV-Liaoning株的LEF-8氨基酸序列比对分析结果Fig.5Sequence alignment of LEF-8 amino acid among the BmNPVYNLC，BmNPV-T3 andApNPV-Liaoning strainsNPV1：BmNPV-YNLC；NPV2：BmNPV-T3；NPV3：ApNPV-Liaoning。黑色三角形表示BmNPV-YNLC株缺失的氨基酸残基；黑色方框表示保守基序GXKX4HGQKGBlack triangles indicated the amino acid residues deleted in BmNPV-YNLC strain；black boxes represented conservative motifs GXKX4HGQKGNPV-C6和BmNPV-H4株中同样存在。此外，除了在646T和1895C为非同义突变，其他位置的替换均为同义突变；BmNPV-YNLC株lef-8基因其他区域未出现核苷酸的插入或缺失。说明BmNPV-YNLC株lef-8基因发生点突变频率不高，并未改变氨基酸序列。2.3系统发育进化分析结果为了厘清云南省德宏州陇川县蚕区BmNPV-YNLC株与其他参考毒株的遗传地位，基于lef-8基因核苷酸序列相似性构建系统发育进化树，以Gen-Bank已公布国内外的13株BmNPV为群内参考，以图 6LEF-8蛋白三级结构预测结果Fig.6Prediction of tertiary structure for LEF-8 proteinA：BmNPV-T3；B：BmNPV-YNLCAB亲水性指数 Hydrophilicity抗原指数Antigennic index表面可及性 Surface probability7期2131表 3不同来源NPVs的lef-8基因核苷酸序列相似性（%）及其遗传距离Table 3Homology analysis（%）and genetic distance of lef-8 gene nucleotide sequence of NPVs from different origins左下角数据为核苷酸序列相似性（%）；右上角数据为遗传距离。毒株编号与表2一致Data in the bottom left half of table were nucleotide homology（%），and data in the upper right half were genetic distance.The strain numbers wereconsistent with Table 2毒株Strain1234567891011121314151617181*99.099.499.499.199.599.799.799.799.499.499.299.299.999.399.197.268.020.010*99.399.499.199.099.098.999.099.199.198.998.999.199.299.197.067.930.0060.007*99.899.399.199.499.399.399.199.599.499.499.499.499.397.268.040.0060.0060.002*99.399.299.399.299.499.299.599.499.399.499.699.397.367.950.0090.0090.0070.007*99.299.199.099.199.199.199.098.999.299.1100.097.167.860.0050.0100.0090.0080.008*99.399.499.499.399.198.998.999.699.499.297.167.970.0030.0100.0060.0070.0090.007*100.099.499.299.499.299.299.799.299.197.268.080.0030.0110.0070.0080.0100.0060.000*99.499.299.399.199.199.799.299.097.168.190.0030.0100.0070.0060.0090.0060.0060.006*99.499.499.299.199.799.399.197.268.0100.0060.0090.0090.0080.0090.0070.0080.0080.006*99.199.099.199.599.299.197.367.9110.0060.0090.0050.0050.0090.0090.0060.0070.0060.009*99.399.299.599.499.197.267.9120.0080.0110.0060.0060.0100.0110.0080.0090.0080.0100.007*99.899.399.299.097.168.1130.0080.0110.0060.0070.0110.0110.0080.0090.0090.0090.0080.002*99.399.298.997.368.2140.0010.0090.0060.0060.0080.0040.0030.0030.0030.0050.0050.0070.007*99.499.297.368.1150.0070.0080.0060.0040.0090.0060.0080.0080.0070.0080.0060.0080.0080.006*99.197.367.9160.0090.0090.0070.0070.0000.0080.0090.0100.0090.0090.0090.0100.0110.0080.009*97.167.8170.0280.0300.0280.0270.0290.0290.0280.0290.0280.0270.0280.0290.0270.0270.0270.029*68.2180.3200.3210.3200.3210.3220.0320.3200.3190.3200.3210.3210.3190.3180.3190.3210.3220.318*表4BmNPV-T3株和BmNPV-YNLC株lef-8基因编码区的单核苷酸多态性分析结果Table 4Analysis of coding-region single nucleotide polymorphisms of lef-8 gene of BmNPV T3 strain and BmNPV-YNLC strain毒株StrainBmNPV-T3BmNPV-YNLC位置 Position9698CAA/Asn-646TCT/SerACT/Thr721CTG/LetTTG/Let852AAC/AsnAAT/Asn1716AAT/AsnAAC/Asn1895ACC/ThrAGC/Ser1902AAG/LysAAA/Lys1911GTT/ValGTC/Val2004ATT/IleATC/Ile2367CGT/ArgCGC/Arg-表示碱基缺失；646TA和1895CG为非同义突变，其他位置的碱基替换均为同义突变，不引起编码氨基酸改变-indicated the absence of a base；646TA and1895CG were non-synonymous mutations，and base substitutions at other locations were synonymousmutations，which did not cause coding amino acid changesBomaNPV、AcMNPV和ApNPV为群外参考，结果（图7）显示，所有BmNPV和BomaNPV聚在最大的分支上，其中，BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近，而与我国流行的BmNPV遗传关系较远。在基于lef-8基因核苷酸序列的同源比对分析中发现，BmNPV-YNLC株与BmNPV-Brazil-ian株的相似性最高（99.9%）、遗传距离最近（0.001）；而基于BmNPV-Brazilian株全基因的遗传进化分析发现，BmNPV-Brazilian株与BmNPV-T3株的亲缘关系最近，故推测BmNPV-Brazilian株起源于日本地区BmNPV株系（Ardisson-Arajo et al.，2014），本研究构建的系统发育进化树进一步验证了该结论。3讨论BmNPV的进化与家蚕进化并行（Lpez-Buenoet al.，2003），病毒同宿主在进化过程中相互博弈，迫于选择压力致使BmNPV的一些基因发生缺失或增加，从而增强病毒侵染宿主及适应环境的能力。BmNPV的宿主家蚕是人为高度驯化的经济昆虫，饲养过程中为追求其经济性状而加大抗病育种和防病措施，导致BmNPV与宿主间的基因交换概率增加，促使BmNPV的基因组呈现多样性。lef-8基因作为杆状病毒的核心基因之一，在不同来源NPVs基因组中高度保守，发挥着不可替代的作用，可用于NPVs不同株系的分子鉴定（Jehle et al.，2006）。多序列比对分析发现，国内外BmNPV和BomaNPV的lef-8基因核苷酸序列相似性均在99.0%以上。与BmNPV-T3株相比，本研究中BmNPV-YNLC株的lef-8基因核苷酸序列在第9698位存在3个碱基（CAA）缺失，并导致1个Asn缺失突变；除了646T和1895C为非同义突变，其他位置的替换均为同义突变。BmNPV-YNLC株LEF-8蛋白在第3234位氨基酸处发生Asn缺失的现象，在BmNPV-C2、BmNPV-C6和BmNPV-H4株系中同样存在，但氨基酸的缺失是否直接影响其毒力还有待进一步探究。本研究基于lef-8基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示，所有BmNPV和BomaNPV聚在最大的分支上，也说明病毒与宿主间存在共同进张永红等：家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析54卷南 方 农 业 学 报 2132化的关系（Herniou et al.，2004）。对BmNPV-YNLC株的lef-8基因进行克隆及测序，并与国内外不同来源BmNPV参考株进行遗传进化分析，结果发现BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近，说明不同地区BmNPV的lef-8基因具有遗传多样性，且呈现出一定的地域性。综合云南省德宏州陇川县引进蚕桑产业发展的历史（张晓买和许珍娣，2018），可确定BmNPV-YNLC株为云南蚕区的新流行株系。云南省蚕区BmNPV流行株系的进化关系与地理位置无直接关系（Zhang et al.，2019），毒株分布不规则，故推测在流行株发生远距离传播中是以人为因素引起的传播为主。在云南蚕区BmNPV流行株系进化关系Clade III中，部分流行株（Y