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试验研究2023年第44卷第21期 总第690期荚膜甲基球菌蛋白遗传毒性研究和被动皮肤过敏试验 高嫣珺1，2 聂 雅1，2 陈秀云3 张思微1，2 刘 瑜1，2 卜仕金1，2*（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；3.扬州大学医学院，江苏扬州 225009）摘 要：荚膜甲基球菌蛋白（Methylococcus capsulatus bacteria meal，MBM）拟开发为新饲料原料。本研究旨在通过遗传毒性研究和被动过敏试验评价其毒理学安全性，为其未来的应用奠定基础。本研究包括四个试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验采用平板掺入法，每皿剂量在 0.62510.000 mg范围内，采用TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535五种菌株进行回复突变试验；小鼠骨髓细胞微核试验和精子畸形试验均设2 500、5 000、10 000 mg/kg三个MBM剂量组，微核试验采用30 h两次给药法，精子畸形试验连续染毒5 d，分别在既定的时间采样制片；大鼠被动皮肤过敏试验设250、500、1 000 mg/kg三个MBM剂量组，制备抗血清后背部皮内注射致敏，24 h和/或48 h后进行抗原激发，考察蓝色反应斑直径。所有试验均根据要求设置阴性、阳性对照组。结果表明：在有或无代谢活化系统结果（S9）时，MBM的鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验结果均为阴性；小鼠骨髓细胞微核和精子畸形试验结果均为阴性；大鼠皮肤被动过敏试验结果为阴性。说明在设置的试验系统和剂量下MBM未显示遗传毒性和潜在的致敏性。关键词：荚膜甲基球菌蛋白；鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验；骨髓细胞微核试验；精子畸形试验；被动皮肤过敏试验doi:10.13302/ki.fi.2023.21.014中图分类号：S816.4 文献标识码：A文章编号：1001-991X（2023）21-0088-06 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Genetic Toxicity Study and Passive Cutaneous Anaphylaxis Test of Methylococcus Capsulatus Bacteria MealGAO Yanjun1,2 NIE Ya1,2 CHEN Xiuyun3 ZHANG Siwei1,2 LIU Yu1,2 BU Shijin1,2*(1.College of Veterinary Medicine Yangzhou University,Jiangsu Yangzhou 225009,China;2.JiangsuCo-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses,Jiangsu Yangzhou 225009,China;3.Medical College of Yangzhou University,Jiangsu Yangzhou225009,China)Abstract：Methylococcus capsulatus bacteria meal(MBM)is intended to be developed as a new feed ingredient.This study was aimed to evluate toxicological safety of MBM through genotoxicity study and passive cutaneous anaphylaxis test,which laying the foundation for its future applications.The Ames test was performed by the plate doping method with doses ranging from 0.625 to 10 mg per dish,reverse mutation test was carried out in five strains of TA97,TA98,TA100,TA102 and TA1535.The mice micronucleus test and the sperm malformation test both performed at 2 500,5 000,10 000 mg/kg.The micronucleus test was conducted using a 30 h double administration method,and the sperm abnormality test was continuously exposed to the MBM for 5 days.Two tests were respectively sampled and produced smear at a predetermined time.The rat passive cutaneous anaphylaxis test was performed at 250,500,1 000 mg/kg.The antiserum was pre作者简介：高嫣珺，硕士，研究方向为兽医药理与毒理学。*通讯作者：卜仕金，教授，博士生导师。收稿日期：2023-08-03基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目；现代农业产业技术体系专项CARS-4188SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期pared and then sensitization by Intradermal injection on the back.Antigenic challenge was performed 24 h and/or 48 h later.Finally the blue reaction spots were examined.Negative and positive control groups were set up for all tests.The results showed that the with or without metabolic activation system(S9),the Salmonella typhimurium reverse mutation assay(Ames test)result was negative;the mice bone marrow cell micronucleus and sperm abnormality test results were both negative;and the rat passive cutaneous anaphylaxis test result was negative.The study suggests that MBM showed no genotoxicity and potential allergy under the set test system and dose.Key words：Methylococcus capsulatus bacteria meal;Ames test;bone marrow cell micronucleus test;sperm abnormality test;passive cutaneous anaphylaxis test豆粕是当前主流的饲料蛋白质原料，2022年饲料中豆粕用量为6 580 t，占比为14.5%1。我国大豆高度依赖进口，2022年进口量达9 108万吨，大部分用于生产饲用豆粕，但自然灾害等因素使其进口有很大的不确定性2。为了应对外部的不确定性，农业农村部于2023年4月12日印发了 饲用豆粕减量替代三年行动方案 的通知，充分挖掘微生物菌体蛋白，实现2025年新批准12种微生物菌体蛋白上市，以减少豆粕依赖，是行动的目标之一3。荚膜甲基球菌蛋白（Methylococcus capsulatus bacteria meal，MBM）来源于天然存在的非转基因微生物的培养物，粗蛋白含量高达65%，主要由甲烷氧化菌荚膜甲基球菌在发酵过程中使用甲烷、氧气、氨氮和矿物质迅速增殖产生，其生产不占用耕地、不使用动植物性原料且仅耗费极少的水资源，相比于传统的动植物蛋白具有显著的优势4-6。研究表明，MBM不仅可代替鱼粉成为大西洋鲑鱼、虹鳟、罗非鱼等水产动物饲用蛋白质来源，在畜禽（断奶仔猪、育肥猪）养殖业同样具有广阔的应用前景7-10。为了将MBM开发为新饲料原料，本研究进行了包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验在内的MBM遗传毒性研究和大鼠被动皮肤过敏试验，提供MBM开发为新饲料原料所需的毒理学安全性评价资料11，为MBM在我国养殖业作为替代蛋白饲料原料应用奠定基础。1 材料与方法1.1 受试物MBM，粗蛋白含量65%，褐色粉末。批号为FNJ012-20210308，由恺迪苏（重庆）有限公司南京中试基地提供。用于Ames试验的不同浓度MBM水溶液使用无菌水溶解；用于小鼠骨髓细胞微核和精子畸形试验的不同浓度的 MBM混悬液使用 0.5%羧甲基纤维素钠配制；用于被动皮肤过敏试验的MBM生理盐水溶液使用生理盐水溶解。不同浓度的MBM溶液均采用2倍递次稀释法配制。1.2 主要试剂环磷酰胺购自Halle公司；Giemsa染液购自Solorbio公司；叠氮钠、敌克松、2-氨基芴、2-氨基蒽和1,8-二羟蒽醌购自Sigma公司；羧甲基纤维素钠、磷酸氢钠铵、枸椽酸、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、二甲基亚砜、D-生物素、L-组氨酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、氧化型辅酶、琼脂粉、牛肉膏、胰胨等购自国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。代谢活化系统（S9）在试验前由多氯联苯在雄性成年Wistar大鼠诱导制备，活力经诊断性诱变剂鉴定符合试验要求。1.3 主要仪器D98-9052B-2隔水式电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；CX2光学显微镜购自Olympus公司；Centrifuge 5415R 高速冷冻离心机、微量移液器购自Eppendorf公司；BCD-251WDGW购自Haier公司。1.4 试验动物与菌株试验动物：清洁级ICR小鼠100只，体重2535 g，其中 75 只为雄性，25 只为雌性；清洁级 Wistar 大鼠250只，体重150180 g，雌雄各半。试验动物均购自扬州大学比较医学中心，动物生产许可证号为SCXK（苏）2022-0009，使用许可证号为 SYXK（苏）2022-0044。89试验研究2023年第44卷第21期 总第690期试验菌株：Ames试验使用的标准测试菌株为组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，购自Moltox公司，经生物学特性鉴定合格后用于试验。1.5 试验方法1.5.1 Ames试验参 考兽 药 Ames 试 验 指 导 原 则12和GB 15193.42014细菌回复突变试验13进行试验设计，根据点试法进行的预试验结果，设高（10 mg/皿）、中高（5 mg/皿）、中（2.5 mg/皿）、中低（1.25 mg/皿）、低（0.625 mg/皿）共 5个 MBM 剂量组，另设阴性对照组（无菌水）及阳性对照组，每个剂量组包括有S9（+S9）和无S9（-S9）两个系列，采用平板渗入法，测试MBM对 TA97、TA98、TA100、TA102和 TA1535的致突变作用，每个MBM剂量组或对照组每种菌株分别设3个平行皿，于 37 培养 48 h后计数每皿的回变菌落数。如果MBM剂量组回变菌落数的增加超过阴性对照组2倍以上，且满足以下两种情况之一：有剂量-反应关系；某一测试点有可重复的阳性结果，则可判定为阳性结果。1.5.2 小鼠骨髓细胞微核试验参考 兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则12和 GB 15193.52014 哺乳动物红细胞微核试验14进行试验设计，设高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）和低（2 500 mg/kg）3个MBM剂量组，另设阳性对照组（环磷酰胺40 mg/kg）和阴性对照组（0.5%羧甲基纤维素钠），每组10只小鼠，雌雄各半。采用30 h两次染毒法，即两次染毒间隔24 h，第2次染毒后6 h采集骨髓样品制片。MBM剂量组和阴性对照组经口灌胃染毒，阳性对照组腹腔注射，高、中、低MBM剂量组染毒药液分别为 0.5、0.25、0.125 g/mL 浓度的 MBM 混悬液，除阳性对照组外各组均灌胃20 mL/kg。每组采样10只小鼠，使用胸骨段骨髓，吉姆萨染色，每只小鼠制片2张。阅片时每张涂片计数嗜多染红细胞（PCE）1 000个，观察并计数其中含有微核的PCE细胞（一个PCE中含多个微核按一个计），同时计数同一视野下的成熟红细胞（RBC）。计算PCE/RBC比值和微核率（），按照公式计算微核率。嗜多染红细胞微核率（）=含微核的嗜多染红细胞/检查嗜多染红细胞总数1 000PCE/RBC应在小鼠的参考值（0.61.2）范围内，阴性对照组微核率应小于5，如MBM剂量组微核率与阴性对照组存在统计学差异，并且呈现剂量-反应关系，则可判定MBM微核试验结果阳性。1.5.3 小鼠精子畸形试验参考 兽药小鼠精子畸形试验指导原则13和GB 15193.72003 小鼠精子畸形试验15进行试验设计，设高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）和低（2 500 mg/kg）3个MBM剂量组和阳性（环磷酰胺40 mg/kg）、阴性对照组（0.5%羧甲基纤维素钠），每组 10只雄性小鼠。MBM剂量组和对照组连续经口灌胃染毒5 d，高、中、低MBM剂量组染毒药液分别为0.5、0.25、0.125 g/mL浓度的 MBM 混悬液，阳性对照组为浓度为 2 mg/mL的环磷酰胺溶液（溶剂为生理盐水），各组灌胃体积均为20 mL/kg。首次染毒后第35天安乐死动物，每组采样10只小鼠，取双侧附睾制片，2%伊红染色，每只小鼠制片2张，每只小鼠计数共1 000个精子中的畸形数，并分类计数（分为无钩、香蕉形、无定性、双头、胖头、尾折叠和双尾），根据公式计算精子畸形率（%）。精子畸形率（%）=畸形精子数/（正常精子数+畸形精子数）100阴性对照组精子畸形率在质控范围（0.8%3.4%）内，且阳性与阴性对照精子畸形率差异极显著（P0.01），则表明该试验系统可靠。MBM剂量组小鼠的精子畸形率为阴性的2倍或2倍以上，或有统计学差异，且存在剂量-反应关系，则可判断试验结果为阳性。1.5.4 被动皮肤过敏试验参考 化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则16进行试验设计，按体重设高（1 000 mg/kg）、中（500 mg/kg）、低（250 mg/kg）3个MBM剂量组，另设阳性对照组（牛血清白蛋白15 mg/kg）和阴性对照组（生理盐水）。10只大鼠，雌雄各半，随机均分为5组，对应各组剂量皮下注射，隔日一次，共3次，MBM剂量组和对照组均注射3 mL/kg，MBM和牛血清白蛋白溶剂均为生理盐水。末次致敏后第14天采血，2 000 r/min离心10 min 分离抗血清，使用生理盐水将各组抗血清为12、18、132三个浓度。将240只大鼠分为5组，中、低 MBM 剂量组各 30 只，其余组各 60 只，雌雄各半，在动物背部预先脱毛3 cm4 cm的区域，皮内注射各对应组不同浓度的抗血清0.1 mL进行被动致敏，中、低MBM剂量组被动致敏24 h，其余组不同抗血清浓度分别致敏24 h和48 h，每组每个浓度不同时间均90SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期致敏10只大鼠。到达致敏时间后，皮下注射与致敏剂量相同的激发抗原进行激发，同时静脉注射 1.0%伊文思兰染料 1.0 mL。30 min后安乐死各组大鼠，剪取背部皮肤，测量皮肤内层的斑点大小，不规则斑点的直径为长径与短径之和的一半，直径大于5 mm者判定为阳性，计算各组的阳性百分率（%）。1.6 数据分析试验结果均采用“平均值标准差”表示，使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，组间统计学显著性比较采用X2检验，显著性水平为0.05，极显著水平为0.01。2 结果与分析2.1 Ames试验Ames 试验结果见表 1，MBM 每皿剂量为 0.62510.000 mg，有或无S9时，5种鼠伤寒沙门氏菌试验株的每皿平均回变菌落数均在阴性对照的两倍以内，未见剂量-反应关系，两次试验结果均一致。表明MBM对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性，MBM的Ames试验结果为阴性。表1 MBM鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果（n=3）组别高剂量组中高剂量组中剂量组中低剂量组低剂量组阴性对照组阳性对照组有(+)/无(-)代谢活化系统(S9)-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9TA97第一次1501114025137271471314613148241561813719142311383014513135142 5871021 85347第二次145211341014339132291363613128135211367143141471914214134142 583761 79796TA98第一次37634535735940342136640142535237336101 104846 100100第二次4073563663864163764043474173463683881 123256 04664TA100第一次153131493315017146191512315971492616313149281412015115148192 6101012 97061第二次151101451315020163111641815520149814113165191581615112159112 6671533 02020TA102第一次262182742226332263162742326615283182632428610283232847279178281072540第二次274142736276282871427926278232773128216277292651327128276268505075030TA1535第一次2422762172382122162172462210235239265319335327第二次246276256254254248244247251233246224323634343注：+S9 阳性对照，TA97、TA98 和 TA100 为 2-氨基芴 10 g/皿，TA102 为 1,8-二羟蒽醌 50 g/皿，TA1535 为 2-氨基蒽5 g/皿；-S9阳性对照，TA97、TA98和TA102为敌克松50 g/皿，TA100和TA1535为叠氮钠1.5 g/皿。2.2 小鼠骨髓细胞微核试验由表2可知，MBM剂量组和阴、阳性对照组PCE/RBC均在参考范围内，雌、雄小鼠MBM剂量组PCE微核率与阴性对照组比较无显著差异（P0.05），且阳性对照组与MBM剂量组、阴性对照组比较差异极显著（P0.01），同一MBM剂量组内雌、雄小鼠微核率显著的性别差异（P0.05）。结果表明，MBM 在 2 50010 000 mg/kg剂量范围内小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性。2.3 小鼠精子畸形试验由表3可知，阴性对照组精子畸形率在质控范围内，MBM剂量组精子畸形率未达阴性对照组的2倍且与阴性对照组比较无显著差异（P0.05），而阳性对照组与 MBM 剂量组和阴性对照组比较差异均极显著（P5 mm。MBM剂量组与阴性对照组比较无显著统计学差异（P0.05），与阳性对照组比较差异极显著（P5 mm000000000000000000101010101010阳性百分率(%)000ns,*0ns,*0ns,*0ns,*100100表2 MBM小鼠骨髓细胞微核试验结果（n=5）组别 高剂量组中剂量组低剂量组阴性对照组阳性对照组性别PCE/RBC值1.020.021.060.051.030.021.110.041.040.061.060.041.050.041.060.031.020.031.010.01PCE微核率（）2.190.57ns,*2.480.98ns,*2.090.56ns,*1.980.61ns,*2.190.82ns,*2.470.49ns,*2.190.832.280.6713.342.1312.221.69注：ns，各MBM剂量组与同性别阴性对照组比较P0.05；*，各MBM剂量组与同性别阳性对照组比较P0.01；下表同。92SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期3 讨论MBM 作为一种非动植物源性的新型可持续功能性蛋白原料在国外沿用已久，商品名为 FeedKind，但其首次进入我国市场，尚未批准使用17。新饲料和新饲料添加剂管理办法11中规定，新饲料原料的申请资料必须包括毒理学安全评价资料，因此对 MBM 进行全面的毒理学安全性评价对其今后在我国畜禽养殖业的应用具有重大的推动作用。前期已完成的大、小鼠急性经口毒性试验和 90 d亚慢性毒性试验结果显示，MBM在大、小鼠的LD50均10 g/kg，无作用剂量至少达到 3 100 mg/kg。本研究所涉及的试验根据前期急性和亚慢性毒性研究结果和相关指导原则要求设置剂量组，保证受试物得到充分暴露。本研究参照 兽药研究技术指导原则12和食品安全国家标准13-15，进行 MBM 的 Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验研究其遗传毒性，其中Ames试验根据要求设置在最高剂量下设4个剂量组，共设5个MBM剂量组；微核试验和精子畸形试验根据要求均设 3 个 MBM 剂量组。同时，参照人用药的相关指导原则16进行大鼠皮肤被动过敏试验，设 3 个 MBM 剂量组，在各剂量组设12、18、132共3个抗血清浓度。在Ames试验中，每皿剂量在 0.62510 mg范围内，在加和不加 S9时，各 MBM 剂 量 组 TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535回变菌落数均与阴性对照接近，远低于阳性的判断标准，表明MBM对鼠伤寒沙门氏菌无致突变作用。骨髓细胞微核试验通过测量微核率来评价受试物对染色体的损伤，本试验剂量下，MBM 对小鼠骨髓细胞的微核率与阴性对照组无统计学差异且未达两倍，三个 MBM 剂量组微核率接近，未呈现明显的剂量-反应关系；同时，小鼠精子畸形试验MBM剂量组各类精子畸形数和总精子畸形率均符合阴性结果的标准。大鼠被动过敏试验中，三个MBM剂量组在不同抗血清浓度和激发时间下，所有动物蓝斑直径均5 mm，均未出现过敏反应。4 结论在本试验条件和剂量下，MBM未显示遗传毒性和潜在的致敏作用，MBM作为新饲料原料使用具有较高的安全性。参考文献1 章勇.再降0.8%，我国饲用豆粕减量替代再进一程N.中国畜牧兽医报,2023-04-09(001).2 刘慧.不要忽视饲用豆粕减量替代N.经济日报,2023-04-20(005).3 农业农村部办公厅印发 饲用豆粕减量替代三年行动方案 J.福建畜牧兽医,2023,45(3):67.4 SPALVINS K,ZIHARE L,BLUMBERGA D.Single cell protein production from waste biomass:comparison 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