亲吻素在青藏高原牦牛睾丸组织中的表达及定位研究.pdf
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1、西 北 师 范 大 学 学 报(自然科学版)第6 0卷2 0 2 4年第1期 J o u r n a l o f N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)V o l.6 0 2 0 2 4 N o.1 D O I:1 0.1 6 7 8 3/j.c n k i.n w n u z.2 0 2 4.0 1.0 1 1收稿日期:2 0 2 3 0 7 1 0;修改稿收到日期:2 0 2 3 0 9 2 8基金项目:国家自然科学基金资助项目(3 1 7 6 0 2 7 1)作者简介:丁
2、艳平(1 9 8 0),女,甘肃会宁人,副教授,博士,硕士研究生导师.主要研究方向为动物生理学.E m a i l:d i n g y p 0 51 6 3.c o m亲吻素在青藏高原牦牛睾丸组织中的表达及定位研究丁艳平,赵 越,张晋平,马佳乐(西北师范大学 生命科学学院,甘肃 兰州 7 3 0 0 7 0)摘要:亲吻素(K i s s p e p t i n)通过下丘脑-垂体-性腺轴对动物繁殖起重要的调控作用.为了探讨亲吻素在牦牛精子发生中的生理功能及其对高原环境的适应机制,文中对比研究了牦牛和黄牛睾丸的组织学特征及其亲吻素的表达情况.结果表明,与黄牛相比,牦牛的曲细精管不饱满,除精原细胞外
3、,牦牛初级精母细胞、次级精母细胞、早期/晚期精子细胞以及精子的数量都显著少于黄牛(P0.0 1).免疫组织化学结果显示,在牦牛的精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、早期精细胞及基质细胞中都可见K i s s p e p t i n免疫阳性产物的表达,这与黄牛表达位置一致,但是牦牛睾丸中阳性产物光密度值(I O D)却显著高于黄牛;牦牛睾丸组织中K i s s p e p t i n蛋白的表达显著高于黄牛(P0.0 1).该结果暗示K i s s p e p t i n可能作为负调控因子,参与维持牦牛精子发生和精子成熟过程中的正常组织结构及其微环境生理状态.关键词:牦牛;睾丸;亲吻素;K i
4、s s-1阳性产物;精子发生中图分类号:S 8 2 6 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 1-9 8 8(2 0 2 4)0 1-0 0 7 0-0 6H i s t o l o g y a n d k i s s p e p t i n e x p r e s s i o n i n t h et e s t i s o f t h e T i b e t a n P l a t e a u y a kD I NG Y a n-p i n g,Z HAO Y u e,Z HANG J i n-p i n g,MA J i a-l e(C o l l e g e o f L i f e S
5、 c i e n c e,N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y,L a n z h o u 7 3 0 0 7 0,G a n s u,C h i n a)A b s t r a c t:K i s s p e p t i n p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n a n i m a l r e p r o d u c t i o n t h r o u g h t h e h y p o t h a l a m i c-p i t u i t a r y-g o n a d a l
6、 a x i s.I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n o f k i s s p e p t i n i n y a k s p e r m a t o g e n e s i s a n d i t s a d a p t a t i o n m e c h a n i s m t o p l a t e a u e n v i r o n m e n t,t h e h i s t o l o g i c a l c h a r a c t e r i
7、 s t i c s a n d e x p r e s s i o n o f k i s s p e p t i n i n t e s t i s o f y a k a n d c a t t l e w e r e c o m p a r e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t c o m p a r e d w i t h c a t t l e,t h e n u m b e r o f p r i m a r y s p e r m a t o c y t e,s e c o n d a r y s p e r m a t o c
8、 y t e,e a r l y/l a t e s p e r m a t o c y t e a n d s p e r m a t o c y t e i n y a k a r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t i n c a t t l e(P0.0 1).I mm u n o h i s t o c h e m i c a l r e s u l t s s h o w e d t h a t k i s s p e p t i n i mm u n o p o s i t i v e p r o d u c
9、 t s a r e e x p r e s s e d i n s p e r m a t o g o n i u m,p r i m a r y s p e r m a t o c y t e,s e c o n d a r y s p e r m a t o c y t e,e a r l y s p e r m a t o c y t e a n d s t r o m a l c e l l o f y a k,w h i c h a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e e x p r e s s i o n p o s i t i o n o
10、 f c a t t l e,b u t t h e I O D v a l u e o f p o s i t i v e s u b s t a n c e s i n t e s t i s o f y a k i s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f c a t t l e.T h e e x p r e s s i o n o f k i s s p e p t i n p r o t e i n i n t h e t e s t i c u l a r t i s s u e o f y a k s
11、 i s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f c a t t l e(P0.0 1).T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t k i s s p e p t i n,a s a n e g a t i v e r e g u l a t o r,i s i n v o l v e d i n m a i n t a i n i n g t h e n o r m a l t i s s u e s t r u c t u r e a n d m i c r o e n v i
12、 r o n m e n t a l p h y s i o l o g i c a l s t a t e o f y a k s p e r m a t o g e n e s i s a n d s p e r m m a t u r a t i o n.K e y w o r d s:y a k;t e s t i s;k i s s p e p t i n s;K i s s-1 p o s i t i v e p r o d u c t;s p e r m a t o g e n e s i s07 2 0 2 4年第1期 丁艳平等:亲吻素在青藏高原牦牛睾丸组织中的表达及定位研究
13、2 0 2 4 N o.1H i s t o l o g y a n d k i s s p e p t i n e x p r e s s i o n i n t h e t e s t e s o f t h e T i b e t a n P l a t e a u y a k 亲吻素(K i s s p e p t i n)是由K i s s-1基因编码的一组多肽,其在哺乳动物生殖内分泌系统中发挥着重要的调节作用1-2.现在已经清楚,K i s s-1主要由下丘脑神经元分泌,通过刺激促性腺激素释放激素(G n RH)神经元细胞上同源的G蛋白偶联受体5 4(G P R 5 4)发挥作用,
14、进而调节初情期生殖功能相关的下游基因.已有研究表明,大鼠和人被注射 K i s s-1基因的表达产物亲吻素后,可以迅速促进黄体生成素和睾酮水平的升高3-4.亲吻素可以推动青春期的启动,维持正常的生殖能力,而且K i s s-1在中枢神经系统和生殖器官中均有表达,与生殖功能密切相关.冯俊鹏等5研究发现,大鼠睾丸中K i s s-1/G P R 5 4的表达在生殖周期的不同阶段表达存在时序性,表明其在大鼠生精细胞成熟的过程中起着一定的调节作用.刘红羽等6发现K i s s-1也表达在山羊附睾中,说明K i s s在精子发生和精子保存过程中可能起着重要作用.荀文娟等7发现,K i s s-1的阳性免
15、疫反应产物表达在五指山猪的睾丸间质细胞、精原细胞、初级和次级精母细胞、圆形精子细胞中;而在精子中,K i s s-1的阳性表达产物却未被发现,表示K i s s-1在精子发生过程中发挥着重要作用.上述研究表明,K i s s-1在雄性哺乳动物的生殖与发育相关调控机制中具有重要作用.牦牛(B o s g r u n n i e n s)是青藏高原地区特有的一种全年放牧动物,对高原高寒、低氧、枯草期长等恶劣条件有极高的适应性.牦牛是一种季节性发情动物,为了使繁殖成功率最大化,会选择在气候温暖、牧草丰茂的暮夏或秋季(6月1 0月)发情,但其繁殖性能较低8.与之生存环境不同,黄牛是一种全年发情的物种,
16、而K i s s-1在牦牛和黄牛睾丸组织内的表达是否有差异,目前尚未见相关报道.本研究以牦牛作为研究对象,通过与黄牛做对比,对其睾丸中的K i s s p e p t i n进行定性、定位和定量研究,以便探讨K i s s-1在睾丸精子发生、雄激素合 成 和 分 泌 中 的 生 理 作 用,为 研 究K i s s-1/G P R 5 4系统对牦牛的季节性发情的调控机制提供基础资料.1 材料和方法1.1 组织采集与处理牦牛组织样品取自甘肃省天祝藏族自治县屠宰场(海拔约3 5 0 0 m),黄牛组织样品取自甘肃临夏屠宰场(海拔约1 3 0 0 m).所采样本均为健康的4头成年(34岁)公牛,平均
17、体重为2 2 0 k g.牛被处死后立即取其睾丸组织,固定于4 0 gL-1的多聚甲醛中,于4 保存备用.1.2 免疫组织化学染色应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(S P法)检测睾丸中相关蛋白的表达9.经固定的睾丸组织进行常规石蜡切片(片厚5 m),使用梯度酒精对切片脱蜡,用柠檬酸钠进行热修复,滴加 H2O2 溶液(3%)去除内源性过氧化物酶的影响,再经 山 羊 血 清 封 闭,滴 加 兔 抗K i s s-1(12 0 0,B o s t e r).在阴性对照组中,以P B S缓冲液代替一抗,4 孵育过夜,用免疫组化试剂盒依次进行二抗、三抗孵育,经二氨基联苯胺法(D A B法)显色后
18、,进行复染和封片.1.3 W e s t e r n b l o t检测提取睾丸总蛋白,采用比辛基奎宁酸(B C A)蛋白检测试剂盒测定蛋白浓 度.含等量蛋白(2 0 g)的样品在蛋白上样缓冲液中煮沸3 m i n,用1 0%S D S-聚丙烯酰胺凝胶分离,转移到聚偏二氟乙烯(P V D F)膜上.用5%脱脂牛奶在P B S中封闭1 h后,用抗K i s s-1多克隆抗体(1 1 0 0 0)在5%B S A中在4 孵育过夜.次日,T P B S洗涤P V D F膜3次,每次1 0 m i n;二抗室温摇床孵育 2 h,T B S T 清洗 3 次,每次 1 0 m i n.增强型化学发光试剂
19、(E C L)检测液放射自显影,用凝胶系统成像仪采集图像.结果用 I m a g e J 进行条带分析.1.4 数据统计在组织切片中随机选择5张,并在每个切片中随机选择1 0个区域在O l y m p u s显微镜下拍照.牦牛和黄牛睾丸中各种类型细胞的鉴定依据文献1 0进行;免疫组织化学切片以胞浆内发现棕褐色颗粒的细胞作为阳性细胞,分析间质细胞、精原细胞、初级和次级精母细胞以及精子细胞的阳性表达,每张切片在固定光亮度下,随机选取5个视野,采用I m a g e-P l u s P r o 6.0软件分析,计算出每张照片的I O D值.所有数据采用S P S S-1 7.0进行t-检验及单因素方
20、差分析,P0.0 5为显著差异,P0.0 1为极显著差异,各组数据以均值标准差表示.2 结果2.1 牦牛睾丸组织结构牦牛睾丸有间质细胞、支持细胞、精原细胞、初级和次级精母细胞、精子细胞、血管以及结缔组织等,结构见图1.从图1可以看出,牦牛的睾丸17西 北 师 范 大 学 学 报(自然科学版)第6 0卷 J o u r n a l o f N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)V o l.6 0 组织要比黄牛更加松弛,并且曲细精管也不如黄牛的饱满(图1 A,A 1,B,B 1);
21、精母细胞和精子细胞的数量皆少于黄牛(P0.0 1),而牦牛精原细胞和支持细胞的数量与黄牛基本一致(图2).A,B,C,D为牦牛睾丸组织学结构;A 1,B 1,C 1,D 1为黄牛睾丸组织学结构;1.曲细精管;2.睾丸间质;3.动脉血管;4.精原细胞;5.初级精母细胞;6.次级精母细胞;7.早期精细胞;8.晚期精子细胞;9.支持细胞;1 0.曲细精管管腔;1 1.间质细胞图1 牦牛和黄牛睾丸的组织学结构(HE染色)F i g 1 H i s t o l o g i c a l s t r u c t u r e o f t h e t e s t i s t i s s u e f o r t
22、h e y a k a n d c a t t l e(HE s t a i n i n g)27 2 0 2 4年第1期 丁艳平等:亲吻素在青藏高原牦牛睾丸组织中的表达及定位研究 2 0 2 4 N o.1H i s t o l o g y a n d k i s s p e p t i n e x p r e s s i o n i n t h e t e s t e s o f t h e T i b e t a n P l a t e a u y a k与黄牛相比,*P0.0 1,n s表示无显著差异图2 牦牛和黄牛睾丸中单位面积生殖细胞和支持细胞密度(N=3)F i g 2 T h
23、e c e l l d e n s i t y o f d i f f e r e n t g e r m a n d s e r t o l i c e l l si n t h e t e s t i s o f t h e y a k a n d c a t t l e(N=3)2.2 K i s s-1阳性免疫反应产物在睾丸组织中的表达对牦牛和黄牛睾丸组织 K i s s-1的阳性表达进行观察(图3),可见在牦牛睾丸实质内的精原细胞、初级和次级精母细胞及精细胞(早期)中均有K i s s-1阳性免疫反应产物的表达,而在晚期精子细胞、精子以及支持细胞中无棕色阳性产物;在睾丸间质中,阳性产
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