泡桐NLR基因家族分析及其对植原体的响应.pdf
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1、2024,44(1):7-20.引文格式:郎雅琴,翟晓巧,曹等.泡桐NLR基因家族分析及其对植原体的响应J.西南林业大学学报(自然科学)JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY UNIVERSITYJan.20242024年1月No.1Vol.44南西业报大学学林第1期第44卷DOI:10.11929/j.swfu.202208042泡桐NLR基因家族分析及其对植原体的响应郎雅琴!翟晓巧2曹喜兵范国强1(1.河南农业大学泡桐研究所,河南郑州450 0 0 2;2.河南省林业科学研究院,河南郑州450 0 0 8)摘要:为研究PfNLR基因家族在白花泡桐抗丛枝病过程中的作用,运
2、用生物信息学方法全面分析了白花泡桐NLR(Pf NLR)家族成员的组成、理化性质、染色体定位、进化、结构、顺式作用元件和组织表达特异性,结合植原体侵染白花泡桐前后的miRNA和转录组的表达量变化,筛选出与抗丛枝病相关的基因。结果表明:白花泡桐中的199个PfNLRs分属6 个亚家族;91.9%的PfNLRs定位在白花泡桐18 条染色体上,其中6 2.8%呈簇状分布,2 3个PfNLRs发生了10 次染色体片段重复事件和1次染色体串联重复事件;PfNLR含激素类和胁迫类元件;miRNA和转录组的关联分析发现泡桐miRNA与PINLR之间存在156 对靶向关系;大多数PfNLRs在芽和根中表达;1
3、6 个PfNLRs在白花泡桐感染植原体前后的表达水平显著差异。进一步分析发现,pf-miRNA482介导的PfNLR181在白花泡桐抗丛枝病中发挥作用,该结果可为解析白花泡桐NLR蛋白的功能提供理论依据。关键词:白花泡桐;NLR家族;植原体;miRNA;转录组中图分类号:S763文献标志码:A文章编号:2 0 95-1914(2 0 2 4)0 1-0 0 0 7-14Analysis of Paulownia NLR Gene Family andtheir Responses to PhytoplasmasLang Yaqin,Zhai Xiaoqiao,Cao Xibing,Fan Gu
4、oqiang(1.Institute of Paulownia,Henan Agricultural University,Zhengzhou Henan 450002,China;2.Henan Academy of Forestry,Zhengzhou Henan 450008,China)Abstract:In order to study the role of PfNLR gene family in Paulownia fortunei resistance to Paulowniawitches broom(PaWB),bioinformatics methods were us
5、ed to comprehensively analyze the composition,physico-chemical properties,chromosomal localization,evolution,structure,cis-acting elements and tissue expression spe-cificity of P.fortunei NLR(PfNLR)family members.Combined with the miRNA and transcriptome data beforeand after phytoplasma infecting Pa
6、ulownia,the genes associated with resistance to PaWB were screened.The res-ults showed that 199 PfNLRs in P.fortunei belonged to 6 subfamilies;91.9%of PfNLRs were located on 18 chro-mosomes of P.fortunei,of which 62.8%were clustered,among them,there were 10 chromosome segment re-peats and 1 chromoso
7、me tandem repeats in 23 PfNLRs;PfNLR contains hormonal and stress elements;integratedtranscriptome and miRNA analysis found that there were 156 pairs of targeted relationships between PfNLRs andmiRNAs;most of PfNLRs were expressed in buds and roots;of which,16 PfNLRs were significantly different be-
8、fore and after phytoplasma infection.Further analysis revealed that PfNLR181 mediated by pf-miRNA482 played收稿日期:2 0 2 2-0 8-2 0;修回日期:2 0 2 2-11-0 8基金项目:中原学者科学家工作室建设专项(豫科2 0 18 18 5)资助。第1作者:郎雅琴(1998),女,硕士研究生。研究方向:泡桐生物技术。Email:。通信作者:范国强(196 4一),男,博士,教授。研究方向:泡桐生物学。Email:。8第44卷西南林业大学学报a role in resistan
9、ce of PaWB.These results could provide a theoretical basis for analyzing the function of PfNLRprotein.Key words:Paulownia fortunei;NLR family;phytoplasma;miRNA;transcriptomeNLR蛋白是细胞内的一类免疫受体,可以直接或间接识别病原物分泌的效应蛋白,激活下游信号通路,引起植物的超敏反应,进而抵御生物胁迫。根据N端结构域不同,将NLR通常分为三大类:Toll白细胞介素受体1蛋白(TIR)-NBS(NBS)-LRR(LRR)、卷曲
10、螺旋蛋白(C C)-NBS-LRR以及缺少N端结构域的NBS-LRR2-3迄今为止,NLR的免疫作用已在多种植物中有了报道4。如沉默棉花中的GhTNL1后再接种大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)会出现严重的萎焉及叶片脱落等黄萎病现象5;过表达GmKP3可以提高大豆对不同病毒的抗性6-7;水稻(O r y z a s a t i v a)CNL蛋白Pb1可以与OsWRKY45相互作用增强水稻对稻瘟菌的抗性8。此外,NLR也可以在miRNA的调控下参与抗病,如大麦(H o r d e u mv u l g a r e)中过表达miRNA9863可以负调控Mlal的表达,削弱大麦对
11、白粉病的抗性9;烟草中过表达nta-MIR6019/6020后,其靶基因N的功能减弱,植物不能产生过敏反应,使植物易感病10;芸苔属植物的bra-miR1885在感染芜菁花叶病毒之后靶向裂解TNL类基因的转录产物,降低植物抵抗力。然而白花泡桐(Pa u l o w n i a f o r t u n e i)NLR(Pf NLR)在白花泡桐抗丛枝病中的作用未见报道,因此深人研究植原体侵染白花泡桐前后PfNLR家族的变化,对揭示白花泡桐抗丛枝病机理具有重要意义。白花泡桐在我国已有2 0 0 0 多年的栽培历史,在防风固沙、园林绿化和改善生态环境中具有重要作用。因其木材不翘不裂、纹理美观,是制作家
12、具、工艺品和乐器的优良材料,大量种植泡桐具有重要的生态和经济价值12。然而在白花泡桐生产中,容易遭受植原体感染患丛枝病,给农林业生产造成了巨大的经济损失13。本课题组前期研究发现植原体侵染白花泡桐前后PfNLR表达量有明显差异,且PJNLR受pfimiRNA的调控14-15,为进一步研究PfNLR在白花泡桐抗丛枝病中的作用,利用白花泡桐基因组数据,鉴定PfNLR家族成员并进行生物信息学分析,结合白花泡桐感染植原体前后的miRNA和转录组数据,筛选与抗丛枝病发生相关的基因,以期为揭示PfNLR在白花泡桐抗丛枝病中的作用提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料以河南农业大学林木生物技术实验室培养的
13、白花泡桐健康组培苗(PF)和植原体感染的组培苗(PFI)为试验材料,培养30 d后,剪取泡桐病苗的顶芽与健康苗的根、茎和顶芽保存于-80冰箱中备用16 1.2PfNLR的鉴定和理化性质分析从Pfam数据库(http:/Pfam.sanger.ac.uk)下载NBS的pfam模型(PF00931),将扫描白花泡桐蛋白数据后获得的成员序列构建白花泡桐特有的 NBSpfam模型,再次扫描获得候选成员,E-value 10-20。同时从 TAIR(h t t p s:/w w W.a r a-bidopsis.org/)数据库下载拟南芥的NBS蛋白序列,在白花泡桐的蛋白库进行blast比对获得第2部分
14、候选成员,E-value10-1。2 部分候选成员合并去重复,最终根据结构域确定成员并分类,并按照NLR家族成员在染色体上从小到大的顺序和在染色体上的位置进行命名,未锚定在染色体上的成员最后命名。利用在线软件Prot-Param(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)分析PfNLR的蛋白理化性质1.3PfNLR的染色体定位及重复事件分析利用TBtools工具中Gene Location Visual-ize绘制PfNLR的染色体分布图,并根据基因簇划定原则确定呈簇状分布的PfNLR17。用TBtools中的MCScanX功能
15、分析获得白花泡桐内以及白花泡桐与拟南芥(Arabidopsis thaliana)之间的基因对18,最后用Circos工具绘制成图。1.4PfNLR的结构和进化分析以及motif预测利用在线工具GSDS2.0(h t t p:/g s d s.c b i.p k t t p s:/me me-s u i t e.o r g/me me/tools/meme)分析获得PfNLR的meme.xml文件,用TBtools对PfNLR的motif和进化树进行可视化分析。使用MAGE7.0.14构建拟南芥和白花泡桐的NLR的NJ(Ne i g h b o r-j o i n i n g)系统发育树,第1
16、期郎雅琴等:泡桐NLR基因家族分析及其对植原体的响应Bootstrap值设为10 0 0,其他参数为系统默认值1.5PfNLR的顺式作用元件分析利用 PlantCare(h t t p:/b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.be/webtools/plantcare/html/)分析PfNLR启动子上游2000bp的顺式调控元件,并用Excel对顺式作用元件功能以及元件数量进行归类统计和可视化。1.6PfNLR不同部位的表达特异性从各个亚家族中挑选16 个PfNLRs做泡桐健康苗不同部位的实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time qua
17、ntitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析(表1);使用植物RNA抽提试剂盒(北京爱普拜生物技术有限公司)提取PF幼苗的顶芽、茎和根的总RNA;PCR反应体系和扩增程序参照Cao等19方法进行。以PfActin为内参基因,2-Ct法计算相对表达量,试验中每个样品3个生物学重复,并用GraphPadPrism分析数据,引物设计选用Primer-BLAST(h t t p s:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。表1PINLR差异基因qRT-PCR所需引物序列Table1Primer sequenc
18、es required for qRT-PCR of differential PfNLR gene基因正向引物(5-3)反向引物(5-3)PfActinAATGGAATCTGCTGGAATACTGAGGACAATGTTACCPfNLR29AGATGGCGAGAATGTGGTGGACGCGGGTTATCTGTGATGGPfNLR33AGGCTGAAAATCTGGCCTCCATTTGCCGTCTCCCATTCGTPJNLR40TGTGCAGATCCTAAAGCAGCAAGGCTTTGCCAGGAGACAAPfNLR62CTGATGTCACCGAGCTTCCATTCCACCCTTTTGGCCTAC
19、CPfNLR71GGACGCATTTCCTTCTGGGAGCAAACAAGCAAGTGCCGTAPfNLR80GGAAGTTGCGGAAGAGGCTAAGCAATTCCCGGTCATCGAAPfNLR111TTTGTGATCCTCCAGATGCCCCCCCAGGAAGGTCTCATTACAPfNLR120ACTCCAAAGAGAGAAAGGATGGGCATCTTCACACATGCACGGPfNLR128TATGCGAAGGGGGTCAGATGATTGCCGAAGGAAGCTCGAAPfNLR149TGCCAAGAAGAGAAGCAGGGGCTTGGGCATGTTGTCAAGGPfNLR158G
20、AAGCAGTTCTCGTGCCTCTGACTTGCGGGTTGATGGAGAPfNLR159CAGCTCTACTTGTGCCGGTTAGTCTTGCGTGTTGTCACCTPfNLR177GCGTCCATGATCTGCTACGAAACGAGGAATACTCAGGCGGPfNLR181TGAGATGGACAGCGGCATACCTGGGAGACACACCAATCCAPfNLR186GTTTCGCTGTTGGGAACCACACCTCAAGTTTGGGCAGCATPfNLR192GTTCTCACAGTTTTACCCGAGGCAGGGAAAGCCAGAGTGGAAG1.7PfNLR对植原体的响应和qR
21、T-PCR验证从NCBI下载白花泡桐感染植原体前后的转录组数据,登录号为SRR11787883、SRR117 8 7 8 94、SRR11787905、SRR117 8 7 9 16、SRR117 8 7 9 2 7 和SRR11787938。根据PfNLR在PF和PFI中的表达,利用TBtools的HeatMap功能绘制FPKM聚类热图14。按照|log2foldchange|2的标准在PJNLR的转录数据中筛选差异基因。提取PF和PFI幼苗顶芽的总RNA,并随机挑选8 个符合差异标准的PfNLRs进行泡桐病健苗的qRT-PCR验证。方法同1.6 的描述。结合本课题组前期的pfmiRNA结果
22、15,利用psRNATarget在线软件(https:/www.zhaolab.org/psRNATarget/analysis?function=2)预测PfNLR 和pf-miRNA的调控关系,错配值为1,选择期望值3,其他分析参数为系统默认。2结果与分析2.1PfNLR的鉴定和理化性质分析白花泡桐中根据是否含有NBS结构域,共鉴定到199个PfNLRs。按照结构域将PfNLR分为6个亚家族:CC-NBS-LRR(CNL)、CC-NBS(CN)、RPW 8-NBS(RN)、T IR-NBS(T N)、NBS-LRR(NL)和NBS(N),CC类PfNLR占比大于TIR类的PfNLR,其中C
23、N类成员最多(47.7%),同时具有C端、NBS和N端的典型NLR家族成员有41个。然后根据命名顺序依次命名为PfNLR1199。理化性质分析结果表明PfNLR的氨基酸个10第44卷西南林业大学学报数在130 148 1;等电点在4.7 8 9.92,大部分成员是弱酸性;亲水性在-0.46 2 0.137,绝大多数蛋白为亲水蛋白;PfNLR中有17 5个成员的不稳定指数大于40,被归类于不稳定蛋白(表2)。表2 PNLR家族理化性质分析Table2Physical and chemical property analysis of PfNLR family蛋白名称氨基酸等电点不稳定指数平均亲水
24、性蛋白名称氨基酸等电点不稳定指数平均亲水性PfNLR18865.6836.50-0.081PfNLR1014967.9640.16-0.288PfNLR212555.8947.23-0.090PfNLR1028628.8541.360.267PfNLR39506.3346.71-0.223PfNLR1037798.0245.11-0.169PfNLR411136.0050.20-0.063PfNLR1043125.9839.980.393PfNLR510535.3141.030.067PfNLR1058477.5345.73-0.159PfNLR69558.3944.460.172PfNLR1
25、066888.3046.670.209PfNLR79598.2147.10-0.145PfNLR1074365.8237.86-0.210PfNLR812067.5044.31-0.146PfNLR1084798.1650.86-0.144PfNLR913466.5150.41-0.159PfNLR1093109.2040.93-0.180PfNLR1013546.0846.55-0.122PfNLR1108429.0646.86-0.081PfNLR1113875.7152.43-0.135PfNLR1118478.9745.300.217PfNLR129398.6249.37-0.182P
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