蒲公英TmRAV1基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析.pdf

植物资源与环境学报 ():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()江苏省自然科学基金项目()江苏省植物资源研究与利用重点实验室开放基金项目()作者简介:吴志清()女山西临汾人硕士研究生主要从事药用植物资源方面的研究通信作者:.引用格式:吴志清 亓希武 房海灵 等.蒲公英 基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析.植物资源与环境学报 ():.蒲公英 基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析吴志清 亓希武 房海灵 于 盱 李 莉 柏 杨 刘 群 梁呈元.南京中医药大学 江苏 南京.江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)江苏省植物资源研究与利用重点实验室 江苏 南京 摘要:根据脱落酸处理的蒲公英(.)的转录组数据在蒲公英中克隆获得 个编码 转录因子的基因序列命名为 的开放阅读框()长度为 编码 个氨基酸 的理论相对分子质量为 理论等电点为 .为不稳定蛋白具有亲水性没有跨膜结构域和信号肽含有 个磷酸化位点 氨基酸序列比对结果显示:与莴苣(.)氨基酸序列的同源性最高(一致性为.)具有高度保守的 和 结构域 系统发育分析结果表明 与其他 种植物的 转录因子聚在一起 在蒲公英叶中的相对表达量显著(.)高于根和花 受 脱落酸和 的显著诱导 能够显著上调脱落酸敏感型转录因子基因 的表达 是核定位转录因子与脱落酸信号核心蛋白家族成员.互作综上所述蒲公英 响应脱落酸等多种信号其编码蛋白与.互作并调控 的表达关键词:蒲公英 基因克隆 表达 脱落酸信号响应中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.).():.().().(.).(.).植 物 资 源 与 环 境 学 报第 卷.:.蒲公英(.)为一种药食同源的多年生植物全草入药具有清热解毒、消肿散结等功效 蒲公英主要有效成分为酚酸类、黄酮类和香豆素类等具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理作用 目前已开发出多种蒲公英产品包括蒲公英根茶、蒲公英花茶、蒲公英挂面和蒲公英酵素等市场需求量大 蒲公英种质资源良莠不齐其产量和质量难以稳定控制因此如何获得高品质的蒲公英新种质资源成为制约该产业发展的一个重要因子利用生物技术改良蒲公英种质资源成为研究的热点之一/(/)转录因子家族成员能够响应多种生物和非生物胁迫激活激素应答信号从而参与调控植物的生长发育过程 根据保守结构域的类型/转录因子家族可分为 个亚家族:()、(/)、()和 ()转录因子含有 端的 结构域和 端的 结构域参与 多 种 逆 境 胁 迫 例 如:在 棉 花(.)中过表达拟南芥(.).和 能提高棉花的抗旱性延迟开花时间并增加纤维长度在拟南芥中过表达大豆 (.).能够提高拟南芥的抗旱和耐盐能力表现出对脱落酸()响 应 不 敏 感 在 黄 瓜(.)中 响应脱落酸信号从而提高黄瓜对盐胁迫的耐受性 进一步研究发现 转录因子还 能 参 与 植 物 对 病 原 体 的 响 应 例 如:番 茄(.)受 外 源 基 因 的调控进而调控致病相关基因的表达从而增强番茄对青枯雷尔氏菌()感染的 耐 受 性 木 薯()和 通 过 调 控 褪 黑 素 合 成 基 因、和 的表达来提高木薯对细菌性 枯 萎 病 的 抵 抗 能 力 且、和 能共同调 节 活 性 氧 含 量 和 下 游 抗 病 基 因、和 的表达进而提高木薯的抗病能力 水稻 在受到条纹病毒和黑条矮缩病毒侵染时其表达量显著变化前期研究结果显示:脱落酸可以显著促进蒲公英次生代谢产物的积累提高蒲公英的品质 因此本研究通过对脱落酸处理的蒲公英转录组数据进行分析筛选出 个差异表达的 基因对该基因编码蛋白进行了氨基酸序列比对、系统进化关系、二级结构、三级结构以及亚细胞定位等分析并分析该基因在蒲公英中的表达模式验证其转录调控特性及蛋白互作的功能以期为研究 转录因子参与蒲公英逆境胁迫的生物学功能提供依据 材料和方法.材料供试野生蒲公英植株和种子均采自南京中山植物园(东经、北纬 海拔 )于 月至 月采集蒲公英全株用蒸馏水清洗干净后分别取根、叶和花液氮速冻后于 保存用于后续 提取于 月至 月采集蒲公英种子于同年 月种植于有机质土壤(南京寿德生物科技有限公司)与蛭石(体积比 )的混合基质中种植 后将蒲公英幼苗移栽至塑料盆(长 、宽 、高 )中每盆 株然后置于人工培养箱(温度、光照时间 )中培养 左右开始实验 共设置 脱落酸()、茉莉酸甲酯()、赤 霉 素()、水杨酸()和 个处理 选择长势基本一致的幼苗每个处理用 第 期吴志清 等:蒲公英 基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析处理液将幼苗喷洒至叶湿润并灌根 分别于处理、和 采集叶用液氮速冻后保存于 冰箱用于后续 提取 每个处理各处理时间取 株作为 个生物学重复.方法.总 提取、合成及基因克隆取蒲公英新鲜叶片用液氮研磨根据 提取试剂盒 ()普洛麦格(北京)生物技术有限公司的使用说明书提取蒲 公 英 叶 片 的 使 用 ()(北京金沙生物科技有限公司)试剂反转录获得蒲公英 根据蒲公英 的 全 长 编 码 序 列()设 计 特 异 性 引 物 和(表)以 为模板利用高保真 聚合酶 ()(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行扩增 扩增体系总体积.包括 .、.、.、上游和下游引物各.、.及.使用 基因扩增仪(杭州博日科技股份有限公司)进行 扩增 扩增程序:预变性 变性、退火、延伸 个循环 终延伸 扩增产物使用质量体积分数 琼脂糖凝胶进行电泳使用 柱式 胶回收试剂盒()生工生 表 用于蒲公英 基因克隆和功能研究的引物相关信息 .引物 序列()()用途 基因克隆 亚细胞定位 实时荧光定量 双荧光素酶分析 .酵母双杂交 .双分子荧光互补 载体通用引物 )下划线示酶切位点 .植 物 资 源 与 环 境 学 报第 卷物工程(上海)股份有限公司获得产物将胶回收产物连接到 克隆载体()(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)上转化至大肠杆菌感受态()(南京擎科生物科技有限公司)利用 卡那霉素进行筛选获得阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序.生物信息学分析从 网站(:./)获得 的同源序列并进行保守结构域分析在 网站(:./)下载拟南芥转录因子氨基酸序列利用 在线工具(:./)分析蛋白质理化特性利用 软件(:./)预测亚细胞定位利用 .软件(:./.?./)分析信号肽利用.在线软件(:././)分析跨膜结构域利用.网站(:././)预测磷酸化位点分别利用在线软件(:./.?.)和(:./)分析二级结构和三级结构利用 软件进行同源序列比对分析利用 .软件采用邻接法绘制系统发育树自展支持率()为 .实 时 荧 光 定 量 ()根 据 的 序列设计荧光定量 引物 和(表)分别提取蒲公英不同组织和不同处理叶的总 反转录获得 使用 酶 ()(北京金沙生物科技有限公司)进行 分析 扩增体系总体积.包括 .、.、上游和下游引物.及 .使用 荧光定量 仪(美国 公司)进行扩增 扩增程序:预变性 变性、退火 、延伸 个循环在 采集信号 以 为内参基因利用 计算相对表达量 每个处理 个技术重复.亚细胞定位分析 使用限制性内切酶 对(:)空质粒进行酶切回收大片段 使用特异性引物 和 克隆获得 编码序列连接至 载体并转化至大肠杆菌感受态 使用载体上游引物 和目的基因下游引物 进行 验证将验证成功的单菌落送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序 测序成功的重组质粒 通过农杆菌转化法转至根癌农杆菌感受态 挑取直径 的农杆菌菌落进行 验证(载体下游引物 和目的基因上游引物)验证成功的农杆菌在 培养基中过夜培养至 值约.于 、离心 去除上清液使用重悬液含 (吗啉代)乙烷磺酸()、和.乙酰丁香酮进行重悬使菌液 值约.注射到本氏烟草()叶片背面进行瞬时表达暗培养 后使用 激光共聚焦显微镜(德 国 公 司)观 察 结 果 以 注 射 含 有 空质粒的农杆菌的叶片为对照实验重复 次.双荧光素酶()分析 根据蒲公英基因组(:./)查找得到 基因的启动子片段利用.设计引物 和 并按照“.”中载体构建的方法将 构建到(酶切位点)载体上得到 重组质粒(用于驱动萤火虫荧光素酶报告基因)转至根癌农杆菌感受态 然后与含有 重组质粒(用于驱动海肾荧光素酶报告基因)的农杆菌按照体积比 共同注射于本氏烟草叶片背面实验步骤参照“.”暗培养 后根据双荧光素酶试剂盒 ()(北京全式金生物技术股份有限公司)说明书对叶片进行处理使用 全自动化学发光/荧光图像分析系统(上海天能生命科学有限公司)观察 将含有 空质粒与 重组质粒的农杆菌按照体积比 共同注射于本氏烟草叶片背面作为对照.酵母双杂交()实验在蒲公英基因组第 期吴志清 等:蒲公英 基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析中通过同源比对筛选获得脱落酸信号核心蛋白家族成员.的同源基因.设计同源重组引物.和.将.连接到(酶切位点)载体上 同 时 设 计 引 物 和 将 构建到(酶切位点)载体上 方法参照“.”将构建好的 和.重组质粒共同转化至酵母菌感受态 中在/培养基上生长 后转移至含 的/培 养 基 上 观 察 是 否 变 蓝 及 空质粒共转化 作为阴性对照.双分子荧光互补()分析 分别将 和.构建到(酶切位点)和 (酶切位点)载体上获 得 和 .重组质粒按照“.”中的方法转化至根癌农杆菌感受态 将含有 和.重组质粒的农杆菌按照体积比 混合后共同注射于本氏烟草叶片背面暗培养 使用 激光共聚焦显微镜观察 和 空质粒共同转化作为阴性对照 结果和分析.基因克隆及蛋白质生物信息学分析.基因克隆及测序分析以蒲公英叶片 作为模板使用特异性引物 扩增得到 条长度约 的条带(图)将胶回收片段连接转化后进行测序测序结果与预期结果一致 开放阅读框()长度为 含量为.编码 个氨基酸(图):.图 蒲公英 扩增产物的电泳结果.图 蒲公英 的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列.同源序列比对及系统发育树构建蒲公英 与其他植物 的氨基酸序列比对结果(图)显示:蒲公英 与其他植物的 具有高度保守的 和 结构域以及核定位信号且与莴苣(.)(登录号.)的同源性最高一致性达.将 与莴苣等 个物种的 以及拟南芥、和 亚家族进行系统发育树的构建结果(图)显示:蒲公英 与莴苣、朝鲜 蓟 .(.).、向日葵(.)和 除 虫 菊 植 物 资 源 与 环 境 学 报第 卷 :蒲公英 .:莴苣 .(.):朝鲜蓟 .(.).(.):向日葵 .(.):除虫菊 ()(.):拟南芥 (.).().括号中编号为 登录号.:保守结构域 :核定位信号 .图 蒲公英 与其他植物 的氨基酸序列比对.:蒲公英 .:莴苣 .(.):朝鲜蓟 .(.).(.):向日葵 .(.):除虫菊 ()(.).括号编号为 登录号.以“”开头的编号均为拟南芥中蛋白质的 登录号.“”(.).图 蒲公英 与莴苣等 种植物的 以及拟南芥、和 亚家族的系统发育树.(.).第 期吴志清 等:蒲公英 基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析()先聚在一起再与拟南芥 亚家族聚为一支.蛋白质理化性质及结构分析 蒲公英 的分子式为 理论相对分子质量为 理论等电点为 .中带正电荷和负电荷的氨基酸残基分别为 和 个 的不稳定指数为.为不稳定蛋白脂肪指数为.总平均亲水指数()为.是亲水性蛋白 预测结果显示 是核定位转录因子 上没有跨膜结构域也没有信号肽(图)上有 个磷酸化位点其中丝氨酸 个苏氨酸 个络氨酸 个(图)二级结构预测结果显示:中含有.螺旋、.折叠、.转角和.无规卷曲(图)以氨基酸相似性为.的拟南芥(.)为模板分子构建 的三级结构预测结果(图)显示:的三级结构也由 螺旋、折叠、转角和无规卷曲构成与其二级结构预测结果一致.表达分析蒲公英 在不同组织和不同处理叶中的表达模式见图 结果显示:蒲公英不同组织中 的相对表达量由高到低依次为叶、花、根且不同组织间差异达到显著(.)水平 在 脱落酸处理下 的相对表达量随着处理时间的延长整体呈先升高后降低的变化趋势在处理 较高 在 茉莉酸甲酯处 :跨膜结构域预测 :信号肽预测 :磷酸化位点预测 :二级结构预测 :三级结构预测 .图 蒲公英 的生物信息学分析.植 物 资 源 与 环 境 学 报第 卷理下 的相对表达量随着处理时间的延长呈“升高降低升高”的变化趋势在处理 和 分别显著高于和低于其他处理时间 在 赤霉素处理下 的相对表达量随着处理时间的延长呈先升高后降低的变化趋势在处理 达到最高 在 水杨酸处理下 的相对表达量随着处理时间的延长呈先升高后降低的变化趋势在处理 达到最高 在 处理下 的相对表达量在处理 内呈逐渐升高的趋势:脱落酸 :茉莉酸甲酯 :赤霉素 :水杨酸 .同一图中不同小写字母表示差异显著(.)(.).图 蒲公英 的表达模式.亚细胞定位分析蒲公英 的亚细胞定位结果(图)显示:对照组:细胞膜和细胞核上有绿色荧光而 仅在细胞核中有荧光说明 定位于细胞核中.启动子分析及 双荧光素酶分析 蒲公英 启动子含有多个顺式作用原件其中包括 个、个、个、个、个 和 个(图)双荧光素酶分析结果(图)显示:实验组(含有:与 的农 :明场 :二脒基苯基吲哚 :绿色荧光蛋白 :叠加视野 .图 蒲公英 的亚细胞定位.第 期吴志清 等:蒲公英 基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析图 蒲公英 启动子分析结果.:对照组 :实验组 .图 中不同小写字母表示差异显著(.)(.).:本氏烟草叶片背面荧光活性图 :实验组与对照组荧光活性相对表 达 量 .图 蒲公英 与 的双荧光素酶分析结果.杆菌共同注射本氏烟草)的荧光素酶活性是对照组(含有:空质粒与 的农杆菌共同注射本氏烟草)的.倍二者间存在显著(.)差异说明 能够显著上调 的表达.酵母双杂交分析将蒲公英的脱落酸信号核心蛋白家族成员.与 进行酵母双杂交分析结果(图)显示:与.能够在酵母体内互作.双分子荧光互补分析双分子荧光互补分析结果(图)显示:将含有 和.的农杆菌共同注射本氏烟草叶片时能够看到黄色荧光蛋白()荧光信号但是 和 共同转化(阴性对照)中没有荧光信号说明 能够与.在本氏烟草体内形成异源二聚体:/培 养 基/:/培养基(含)/().图 蒲公英 与.酵母双杂交分析结果.:明场 :黄色荧光蛋白 :叠加视野 .图 蒲公英 与.双分子荧光互补分析结果.植 物 资 源 与 环 境 学 报第 卷 讨论和结论/超家族成员 转录因子是植物中特有的一类转录因子主要参与植物的生长发育及其非生物胁迫响应过程已经在多种植物中有相关报道如水稻(.)、小黑杨(.)、御 谷 (.).、枇杷(.).、甘蔗(.)等 本研究从蒲公英中克隆得到 个 转录因子基因 与莴苣 氨基酸序列的一致性达到.属于 亚家族 有 个磷酸化位点因此可能被 等蛋白激酶磷酸化 亚细胞定位结果显示 定位于细胞核这与转录因子在细胞核中发挥的作用一致且与先前的预测结果相同 具有 端 结构域和 端 结构域与已有研究报道一致因此 可能与()、和 序列结合 参与调节激素、干旱和盐胁迫反应 结果表明蒲公英叶中的 受多种激素和 胁迫诱导 受 脱落酸的显著调控其相对表达量在处理 内整体先升高后降低在处理 较高说明 可能参与脱落酸信号通路 在 处理下 的相对表达量在处理 内持续升高说明 能够持续响应 胁迫后续实验需要降低 溶液的浓度或者延长处理时间至 在 茉莉酸甲酯处理下 的相对表达量在处理 先升高后降低并在处理 达到峰值而在处理 又再次升高可能涉及茉莉酸信号负调控作用机制 在 赤霉素处理下 的相对表达量在处理 内也先升高后降低显示 可能参与赤霉素信号通路 在水稻中水杨酸处理上调了、和 的 表 达 下 调 了、和 的表达 本研究中 在 水杨酸处理下表达模式与 赤霉素处理相似 根据上述研究结果 受脱落酸调控最为显著因而可能参与脱落酸信号转导 脱落酸信号是植物抵御环境胁迫的重要组成部分因此后续研究应聚焦于脱落酸对 的调控机制脱落酸应答元件结合蛋白()是脱落酸敏感型转录因子 在拟南芥中 能够介导 依赖性脱落酸信号转导从而增强拟南芥的抗旱 性 丹 参()中 的 能够响应脱落酸信号调控酚酸合成在番茄中过表达 能够提高植株在盐碱胁迫下的抗氧化能力 因此 转录因子参与植物抵抗逆境胁迫并调控植物次生代谢 在拟南芥中 抑制 的表达进而促进种子萌发和幼苗发育 在棉花中过表达/和 能够增强棉花的抗旱能力并最终提高产量 与已报道的莴苣 同源性较高可能存在 调控模式 本研究初步证明 促进 表达且 启动子上含有(转录因子结合元件)后续将通过酵母单杂交和电泳迁移率实验验证 是否直接靶向结合 蛋白激酶是脱落酸信号通路中的关键蛋白质家族之一 在拟南芥中 能够调控其种子的发育和休眠其中.、.和.还能够通过响应脱落酸信号调控气孔关闭适应干旱环境 苹果(.)中的.和.参与渗透胁迫响应被激活并进而磷酸化 和 促进乙烯合成从而调控果实成熟 拟南芥中的 能够磷酸化、和 等转录因子参与脱落酸信号通路下游的信号转导 本研究通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验初步验证了 与脱落酸信号途径核心蛋白家族成员.互作后续将通过 和 实验验证 和.是否直接互作基于上述研究后期将通过获得 转基因蒲公英进一步验证 在脱落酸信号途径中的具体作用机制为蒲公英优质资源创新提供基础参考文献:国家药典委员会.中华人民共和国药典:年版(一部).北京:中国医药科技出版社:.第 期吴志清 等:蒲公英 基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析 .():.():.:.张松保 孔令婕 谷 巍 等.基于/技术的蒲公英化学成分分析及其抗癌机制的网络药理学研究.天然产物研究与开发 ():.().():.付晨青 何立威 王秀萍 等.药食同源蒲公英的开发应用研究现状与展望.陕西农业科学 ():.悦曼芳 张 春 吴忠义.植物转录因子/家族蛋白结构和功能的研究进展.生物技术通报 ():.():./.:.():.():.:.:.:./.():.():.():.():.:.:.:./.:.靳春慧 文小卉 刘羽婷 等.小黑杨 与 基因的克隆与表达分析.西北农林科技大学学报(自然科学版)():.周梦蝶 王泽玉 王辰雨 等.御谷 基因及启动子的克隆与生物信息学分析 .分子植物育种 ():.():.庞彩红 李双云 夏 阳 等.植物非 依赖型 研究进展.植物生理学报 ():./.():.():./.:.:植 物 资 源 与 环 境 学 报第 卷 .():.杨金荣 崔婉宁 张瑜 等.基于转录组数据的半夏/基因家族鉴定及逆境响应分析.中国实验方剂学杂志 ():.().():.():.:.:.():.:.():.():.()/.():.():./././.():.():.():.():.(责任编辑:张明霞)(上接第 页 ).(.).:.:.().():.:.杨 阔.苹果 型锌指蛋白 调控叶片衰老和干旱胁迫的机理研究.泰安:山东农业大学:.():.(责任编辑:张明霞)