加入脾氨肽口服液培养的人肺癌细胞系A549增殖凋亡及线粒体膜电位、活性氧簇表达观察.pdf
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1、山东医药2023 年第 63 卷第 30 期加入脾氨肽口服液培养的人肺癌细胞系A549增殖凋亡及线粒体膜电位、活性氧簇表达观察石颖慧1,王铁山2,王煊3,卢涛11 北京中医药大学生命科学学院,北京102488;2 北京中医药大学北京中医药研究院;3 北京中医药大学第三附属医院呼吸科摘要:目的观察脾氨肽口服液对人肺癌细胞系A549增殖凋亡迁移是否有影响,并进一步探讨脾氨肽口服液的可能作用机制。方法取对数生长期A549细胞,随机分为四组,1、2、3组分别在含10%胎牛血清的DMEM培养基中加入0.5、1.0及2.0 mg/mL脾氨肽口服液,4组不做任何处理,观察细胞的增殖、凋亡及迁移情况,检测各组
2、细胞线粒体膜电位及活性氧簇(ROS)。结果与4组比较,培养24 h时1、2、3组细胞的细胞活力低,各时间点2、3组细胞的细胞汇合度低、相对划痕区域密度小;培养24 h时1、2、3组细胞的细胞凋亡率高,线粒体膜电位低,培养24 h时2、3组细胞的ROS相对表达量高(P均0.05)。随脾氨肽口服液浓度上升,A549细胞活力逐渐下降、细胞汇合度降低、细胞凋亡率升高、相对划痕区域密度降低、线粒体膜电位下降,ROS相对表达量升高,且呈剂量依赖性(P均0.05)。结论脾氨肽口服液可抑制A549细胞的增殖迁移,促进细胞凋亡,其中2.0 mg/mL的脾氨肽口服液作用更明显。脾氨肽口服液可能通过降低细胞线粒体膜
3、电位、促进细胞ROS表达抑制A549细胞的增殖迁移、促进细胞凋亡。关键词:脾氨肽口服液;肺癌;细胞增殖;细胞凋亡;细胞迁移;线粒体膜电位;活性氧簇doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2023.30.002 中图分类号:R734.2 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2023)30-0006-05Observation on proliferation,apoptosis,mitochondrial membrane potential,and expression of reactive oxygen species in human lung cancer
4、cell line A549 cultured with spleen aminopeptide oral solutionSHI Yinghui1,WANG Tieshan,WANG Xuan,LU Tao1 School of Life Sciences,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 102488,ChinaAbstract:Objective To observe whether spleen aminopeptide oral solution has any effect on the proli
5、feration,apoptosis and migration of human lung cancer cell line A549,and to further explore the possible mechanism of action of spleen aminopeptide oral solution.Methods A549 cells in the logarithmic growth phase were randomly divided into four groups:groups I,II,III,and IV.Cells in the groups I,II
6、and III were added with 0.5,1.0 and 2.0 mg/mL spleen aminopeptide oral solution in DMEM medium containing 10%fetal bovine serum,and cells in the group IV were not treated.We observed the proliferation,apoptosis,and migration of cells and detected the mitochondrial membrane potential and reactive oxy
7、gen species(ROS)in cells of each group.Results Compared with the group IV,the cell viability of cells in the groups I,II and III at 24 h of culture was lower,the cell confluence of cells in the groups II and III at all time points was lower,and the density of relative scratch area was smaller;the ap
8、optosis rates of the groups I,II and III at 24 h of culture were higher,the mitochondrial membrane potential was lower,and the relative expression levels of ROS in cells in the groups II and III at 24 h of culture were higher(all P0.05).With the increase of the concentration of splenic aminopeptide
9、oral olutionn,the viability of A549 cells gradually decreased,the cell confluence decreased,the apoptosis rate increased,the density of relative scratch area decreased,the mitochondrial membrane potential decreased,and the relative expression of ROS increased,and it was in a dose-dependent manner(al
10、l P0.05).Conclusion Spleen aminopeptide oral solution could inhibit the proliferation and migration of A549 cells and promote the apoptosis of these cells,with the most obvious effect of spleen aminopeptide oral solution at a concentration of 2.0 mg/mL.The spleen aminopeptide oral solution might exe
11、rt the above effects by decreasing the mitochondrial membrane potential and promoting the expres第一作者简介:石颖慧(1998-),女,硕士,主要研究方向为免疫调节。E-mail:通信作者简介:卢涛(1968-),男,博士,教授,主要研究方向为中西医结合基础。E-mail:T开放科学(资源服务)标识码(OSID)6山东医药2023 年第 63 卷第 30 期sion of cellular ROS.Key words:spleen aminopeptide oral solution;lung ca
12、rcinoma;cell proliferation;apoptosis;cell migration;mitochondrial membrane potential;reactive oxygen speciesWHO国际癌症研究机构(IARC)的GLOBOCAN项目分析报告1表明,2020年全球新增肺癌患者约220万例,占全部新发恶性肿瘤的 11.4%。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一2。肺癌的治疗方法分为外科治疗、放射治疗和药物治疗,药物治疗包括化学疗法、分子靶向治疗和免疫治疗等3。寻找高效安全的肺癌治疗药物是世界范围内的研究热点。多肽类药物可能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡发
13、挥直接抗肿瘤作用,也可通过增强和激发机体对肿瘤细胞的免疫应答、抑制肿瘤血管生成等发挥间接抗肿瘤作用4。研究5发现,线虫中分离的 Mere15 可能通过提高人肺腺癌细胞活性氧簇(ROS)、抑制癌细胞的线粒体膜电位,促进癌细胞凋亡。脾氨肽口服液是一种免疫调节剂,主要是从健康牛脾脏中提取的多肽氨基酸和多肽核苷酸混合物,目前主要用于慢性肝炎和过敏性鼻炎的治疗中6。研究7-8发现,脾氨肽口服液中的四肽活力成分塔夫素可以通过提高巨噬细胞吞噬作用,发挥抗感染、抗肿瘤作用。脾氨肽口服液对肺癌细胞的增殖、凋亡迁移的影响及其可能作用机制,目前相关研究较少。2023年15月,我们观察了脾氨肽口服液对人肺癌细胞系A5
14、49增殖凋亡迁移的影响,并进一步探讨脾氨肽口服液的可能作用机制,现将结果报告如下。1 材料与方法 1.1细胞、试剂及仪器A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。脾氨肽口服液(北京第一生物化学药业有限公司,国药准字:H10950310,规格为10 mL:10 mg多肽;0.1 mg核苷酸),磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)和DMEM培养基、青-链霉素(P/S)溶液和胰蛋白酶购自美国Gibco,细胞增殖-毒性检测试剂盒Cell counting Kit-8 CCK-8、JC-1 线粒体膜电位荧光探针及 DCFH-DA ROS荧光探针购自北京兰博利德,Annexin V-
15、FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购自美国 BD。CO2培养箱购自美国NUAIRE,高速离心机购自美国Thermo,冷冻 干 燥 机 购 自 德 国 CHRIST,酶 标 仪 购 自 美 国BioTek,InCucyte S3长时间动态活细胞成像及功能分析系统购自美国Essen Bioscience,流式细胞分析仪LSRFortessa SORP购自美国BD。1.2A549细胞分组及脾氨肽口服液给予方法取对数生长期A549细胞,在含10%胎牛血清和1%青-链霉素溶液的DEME培养基中培养,置于37,5%CO2培养箱中培养,每2天换液一次,待细胞融合度达到90%时,胰蛋白酶消化后传代备用。脾氨肽口
16、服液指导用量10 mL/天,即多肽浓度1.0 mg/mL,本研究将其设为中剂量浓度,0.5倍浓度为低剂量浓度(0.5 mg/mL),2倍为高剂量浓度(2 mg/mL)。将细胞分为四组,1、2、3组分别在含10%胎牛血清的DMEM培养基中加入0.5、1.0及2.0 mg/mL脾氨肽口服液,4组不做任何处理。1.3各组细胞细胞增殖情况观察培养24 h时采用CCK-8法检测各组细胞活力。取各组细胞,加入CCK-8试剂后培养1 h,使用酶标仪测量各组细胞波长450 nm处的光密度OD值,根据OD值计算各组细胞活力。细胞活力=A(加药孔OD值)-A(空白孔OD 值)/A(对照孔 OD 值)-A(空白孔
17、OD 值)。干预后即刻(培养0 h)将各组细胞置于IncuCyte S3活细胞动态成像与分析仪器(可对活细胞进行长时程动态监测)中观察各组细胞的增殖情况。每3 h拍照记录1次,连续监测36 h,由InCucyte内置算法利用拍摄图片测算细胞汇合度(衡量细胞数量的变化,代表细胞增殖情况)。以培养0 h时细胞汇合度为基准进行归一化,测算各组培养3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h时的细胞汇合度。实验重复测算3次,取平均值。1.4各组细胞迁移情况观察培养0 h时取各组细胞,立刻放入InCucyte S3长时间动态活细胞成像及功能分析系统,每2 h拍照记录1次,连续拍照36 h。由
18、InCucyte内置算法利用拍摄图片计算相对划痕区域密度(某一个时间点划痕面积占初始划痕面积百分比,代表细胞迁移能力)。以培养0 h时细胞相对划痕区域密度为基准进行归一化,测算各组培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h时各组细胞相对划痕区域密度。实验重复测算3次,取平均值。1.5各组细胞凋亡情况观察采用流式细胞术。培养48 h时取各组细胞,用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化,400 g离心5 min,弃去上清液,加入300 L Binding Buffer重悬细胞并收集培养7山东医药2023 年第 63 卷第 30 期上清中的细胞
19、。加入5 L的Annexin V-FITC,避光室温孵育15 min,在上机前5 min再加入5 L的PI进行染色,使用流式细胞仪测算各组细胞凋亡率。实验重复测算3次,取平均值。1.6各组细胞线粒体膜电位检测培养24 h时取各组细胞,600 g离心5 min后弃上清,加入0.25%的胰蛋白酶消化下孔板上的细胞,400 g离心5 min后弃上清。使用JC-1线粒体膜电位荧光探针检测线粒体膜电位,0.5 mL的JC-1工作液重悬细胞,37 孵育15 min,400 g离心5 min后弃上清,PBS洗涤2次,加入500 L的PBS重悬细胞,使用流式细胞仪进行检测,选择525 nm激发,PE通道检测以
20、及490 nm 激发,FITC 通道检测分析测算线粒体膜电位。实验重复测算3次,取平均值。1.7各组细胞 ROS 检测培养 24 h 时取各组细胞,0.25%的胰蛋白酶消化,400 g离心5 min,用无血 清 培 养 液 将 DCFH-DA 稀 释 至 终 浓 度 为10 mol/L,每 个 细 胞 样 品 加 入 1 mL 稀 释 好 的DCFH-DA 工作液重悬细胞,于细胞培养箱内孵育30 min。待孵育完成后用无血清培养基洗涤细胞2次,使用流式细胞仪测算DCFH-DA的荧光值(代表细胞ROS相对表达量)。实验重复测算3次,取平均值。1.8统计学方法采用 SPSS 26.0 统计软件进行
21、数据处理。正态性检验采用 Shapiro-Wilk 检验,符合正态分布的计量资料以-x s表示,组间比较用独立样本t检验或方差分析(ANOVA),进一步两两比较用SNK-q法。P0.05为差异具有统计学意义。2 结果 2.1各组细胞增殖情况比较培养24 h时1、2、3、4 组 细 胞 的 细 胞 活 力 分 别 为 80.62%5.30%、49.10%10.03%、39.03%6.37%、100.00%6.17%。与4组比较,培养24 h时1、2、3组细胞的细胞活力低(P均0.05),随脾氨肽口服液浓度上升,细胞的细胞活力逐渐下降,且呈剂量依赖性(F=91.659,P0.05)。培养3、6、9
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