荧光定量PCR简介.ppt
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1、荧光定量PCR简介目录目录目录4 4荧光定量PCR原理1 12 23 3定量PCR的实验流程几种定量方法的比较 StepOne Plus与ViiA7比较及应用 QPCR定量的常见问题5 5什么是PCR1.1 1.1 什么是什么是PCRPCR?1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR原理原理理想的理想的PCR以以2n次方扩增,即:次方扩增,即:DNAn=DNA02nQPCR定义 Real time Q-PCR 通过对 PCR 扩增反应中每一次循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。1.2 QPCR1.2 QPCR定义定义1.3 1.3 数学原理数学原理Real time Q-
2、PCR动力学曲线可以分成四个阶段:基线阶段,指数增长期、线性增长期和平台期。基线阈值CT值 DNA0定量定量PCRPCR的几个重要的参数:的几个重要的参数:基线就是扩增曲线的水平部分。什么是阈值什么是阈值?基线(空白)信号的产生是由于背景引起的。默认阈值=基线(背景)信号标准偏差x10什么是什么是CTCT值值?荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,一般荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数被称为 CT 值(Threshold Value)。PCRPCR扩增的数学模型扩增的数学模型扩增产物遵循理论方程:DNAn=DNA
3、0(1+E)nDNAn=扩增产物,DNA0=起始浓度,E=扩增效率,n=循环数CtCt值与起始浓度的关系值与起始浓度的关系标准曲线标准曲线利用已知拷贝数的标准品,按利用已知拷贝数的标准品,按10倍浓度稀释倍浓度稀释5个成梯度,做出标准曲线,其个成梯度,做出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样值。因此,只要获得未知样品的品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。斜率斜率Ct=-klg DNA0+b 斜率=-1/lg(1+e)E=1,斜率=-3.32 扩增效
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