中国药典2010版附录XII-E-细菌内毒素检查法.doc
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1、(完整版)中国药典2010版附录XII E 细菌内毒素检查法中国药典2010版附录XII E 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验.当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准.本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU )表示,1EU 与1 个内毒素国际单位(IU )相当。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎
2、试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的赏试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0。O15EUml(用于凝胶法)或0。005EU / ml (用于光度侧定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素.耐热器皿常用干热灭菌法(250 、30 分钟以上 ) 去除,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。供试品溶液的制备 某些供试品需
3、进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH 值在6。08。0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的pH 值,可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子.内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定: L=K / M式中 L 为供试品的细菌内毒素限值,一般以EU /ml、EU / mg 或EU / U (活性单位)表示;K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU / ( kg h )表示
4、,注射剂K = 5EU/(kgh ) ,放射性药品注射剂K=2.5EU / (kg h ) ,鞘内用注射剂K = 0。2EU / (kg h ) ;M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,以ml / ( kg h )、mg / ( kg h )或U / ( kg h )表示,人均体重按60kg 计算,人体表面积按1。62m2 计算.注射时间若不足1 小时,按1 小时计算.供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027 即可转换为每千克体重剂量(M)。按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用药实际情况做必要调整,但需说明理由。确定最大有效稀释倍数(MVD ) 最大有效稀释倍数是指在试
5、验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数( 1MVD ),在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD :MVD=cL / 式中L 为供试品的细菌内毒素限值;c 为供试品溶液的浓度,当L 以EU / ml 表示时,则c等于1。0ml / ml ,当L 以EU / mg 或EU / U 表示时,c的单位需为mg / ml 或U / ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MVD 取1 ,可计算供试品的最小有效稀释浓度c=/L ;为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度 EU / ml ) , 或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度.方法1 凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与
6、内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU / ml 表示.当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。根据赏试剂灵敏度的标示值(),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡棍合器上混匀15分钟,然后制成2、0.5和0.25四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 秒钟。取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10mm75mm 试管或复溶后的0。1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18
7、 支,其中16 管分别加入0。1ml 不同浓度的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做4 管;另外2 管加人0.1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放人37 士1 的恒温器中,保温60 分钟2 分钟。将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转l80 ,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。当最大浓度2管均为阳性,最低浓度0。25管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(c).can
8、tilg (X / 4 )式中 X 为反应终点浓度的对数值(lg ).反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当c在0.52(包括0。52)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验 按表1 制备溶液A 、B 、C 和D ,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数( MVD )的溶液,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。表l 凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液-2B2/供试品溶液供试品溶液12421440。5480.254C2/检查用水检查用水
9、12421440.5480。254D无/检查用水-2注:A为供试品溶液;B为干扰试剂系列;C鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D为阴性对照。只有当溶液A 和阴性对照溶液D 的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算系列溶液C 和B 的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et ) :Es= antilg (Xs / 4 )Et=antilg (Xt : / 4 )式中Xs Xt分别为系列溶液C 和溶液B 的反应终点浓度的对数值(lg)。当Es在0。52(包括0.5和2)及Et在0.5Es 2 Es (包括0。5Es和 2 Es)时,认为供试品在该浓度下
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