学士学位论文orfh79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定.doc
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1、NANCHANG UNIVERSITY 学 士 学 位 论 文 THESIS OF BACHELOR(20XX20XX年)题 目: orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定 学 院: 生命科学院 系 生物技术系 专业班级: 生物工程 学生姓名: XX 学号: XXXXXXXX 指导教师: XXX 职称: XXXX 起讫日期: XXXXXX 南 昌 大 学学士学位论文原创性申明本人郑重申明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明
2、确方式表明。本人完全意识到本申明的法律后果由本人承担。作者签名: 日期:学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密,在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于 不保密。(请在以上相应方框内打“”)作者签名: 日期:导师签名: 日期:摘要orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定专 业:生物工程 学 号:XXX学生姓名: XX 指导教师: XXX摘
3、要细胞质雄性不育(CMS)现象在植物中普遍存在,表现为雄性败育,但雌配子和营养生长正常。用于三系杂交水稻避免人工去雄,具有很高的实用价值。然而细胞质雄性不育是细胞核质互作的结果,可以为研究核质互作的分子机理提供一个很好的材料。线粒体基因组分子内形成异常嵌合基因是CMS产生的基础,由于水稻花药线粒体体外培养及植物线粒体直接转化技术的限制,水稻CMS分子机理研究进展缓慢。然而细菌基因的转录和翻译及能量合成方式与线粒体具有较大的相似性。线粒体基因orfH79是水稻红莲型细胞质雄性不育基因。所以本实验将不育基因导入大肠杆菌中来研究。线粒体中央是基质,基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类,内膜上具有呼吸
4、链酶系及ATP酶复合体。线粒体对呼吸作用的能量代谢起重要作用,而丙酮酸激酶是能量代谢的关键酶。本实验就是研究orfH79基因对丙酮酸激酶的影响,即通过测酶活来表明,就是看orfH79基因对丙酮酸激酶的酶活的影响。本实验就是通过测定管和对照管的丙酮酸激酶酶活的大小,来推出orfH79基因对丙酮酸激酶的酶活影响,最终推出不育基因对丙酮酸激酶的影响。关键词:细胞质雄性不育;orfH79基因;大肠杆菌;丙酮酸激酶酶活IAbstractIIIorfH79 transformed e. coli enzyme determination of pyruvate kinaseAbstractThe phen
5、omenon of cytoplasmic male sterility (CMS) is widespread in plants,performance of abortive male, but female gamete and vegetative growth normal. It is used for three-line hybrid rice to avoid artificial emasculation, has the very high practical value.Cytoplasmic male sterility (CMS) is the nucleus i
6、nteractions, however as a result, to study on molecular mechanism of karyoplasm interaction provides a good material. Mitochondrial genome within molecules form abnormal chimeric gene is the basis of CMS to produce, because the rice anther mitochondrial mitochondria in vitro culture and plant the li
7、mitation of direct conversion technology, rice CMS molecular mechanism research progress has been slow. However, bacterial gene transcription and translation and energy synthesis method and mitochondria has great similarities. Mitochondrial genes orfH79 type is red-violet rice cytoplasmic male steri
8、le genes. So this study will research sterility gene into e. coli. Mitochondria, the central is a matrix, matrix contains all the required enzymes and the Krebs cycle, the lining of respiratory chain enzymes and ATP enzyme complexes. This experiment is to study the effect of orfH79 gene of pyruvate
9、kinase, namely by measuring the enzyme activity show that is watching orfH79 genes affect enzyme activity of pyruvate kinase. This study is through the tube and to take care of the size of the pyruvate kinase enzyme activity, to launch orfH79 genetic influence on the enzyme activity of pyruvate kina
10、se, finally introduced sterility gene effects on pyruvate kinase.Key words:cytoplasmic male sterility;OrfH79 gene;E. coli;Pyruvate kinase enzyme activity目录目录摘要 .Abstract .目 录 .第一章 引言 .11.1植物细胞质雄性不育研究意义 .11.2植物细胞质雄性不育可能的形成机理 .11.3线粒体基因与植物细胞质雄性不育 .21.4 利用大肠杆菌研究植物细胞质雄性不育 .31.5 丙酮酸激酶与线粒体的关系 .51.6 研究目的及意
11、义 .5第二章 材料与方法 .72.1实验材料与试剂 .72.2试验方法.8第三章 实验结果与分析.10第四章 实验讨论.134.1微量orfH79蛋白抑制丙酮酸激酶的酶活 .134.2 orfH79基因抑制大肠杆菌生长机理 .14参考文献 .16致谢 .19第一章 引言第四章 结论第一章 引言15第一章 引言1.1 植物细胞质雄性不育研究意义植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility , CMS)是一种因线粒体基因区域的改变(突变、重排、转座等)所导致的、不能产生有活力花粉的母状遗传性状,是高等植物中较为常见的生物学特征,广泛存在于大约150个物种中。由于细胞质
12、雄性不育系统在研究核质互作、细胞器遗传转化、杂交种商业化生产等方面所具有的优势,科学家们做出了长期的努力、希望弄清其形成机理。以前的研究大多集中在对CMS的花粉败育时期和原因、不育的稳定性及可恢复性等进行了较多的经典研究。随着分子生物学理论和技术的迅速发展更新,特别是细胞器分离技术和离体翻译体系的建立,极大地推进了在分子水平对植物细胞质雄性不育机理的研究,丰富了人们对CMS现象的认识。本文则是利用水稻雄性不育来研究核质互作。1.2植物细胞质雄性不育可能的形成机理尽管在一些植物中已经鉴定出与CMS有关的线粒体DNA片段,但是对植物细胞质雄性不育的机理仍然知之甚少。一般推测,植物CMS形成机理有两
13、种:第一种线粒体基因组中新的嵌合阅读框与其相邻近的保守基因共转录,造成保守基因的单顺反子转录本减少,从而减少了保守基因编码的蛋白量 致使植物的某些功能异常或丧失而不育;第二种新的嵌合阅读框编码了一个毒性蛋白,该蛋白干扰保守基因的生物活性或干扰花药发育中的生理生化过程从而中断花粉发育形成雄性不育。从恢复基因对CMS的影响来看,如果是第一种原因引起CMS,那么相应的恢复基因就应该是通过恢复保守基因的表达量来起作用。对几种植物CMS的研究显示,在恢复基因有与无的两种遗传背景下,虽然嵌合基因的转录模式有明显不同,但都可以检测到线粒体保守基因转录本的存在,且在量上没有明显的区别。这表明第一种解释并不理想
14、。对第二种解释目前有较多的实验支持。He等将含特异启动子、线粒体转导序列、菜豆的不育相关基因orf239的序列导入烟草细胞核基因组,获得了几株含有orf239的不育和半不育的转基因植株。免疫细胞学分析表明,在转基因植株中异常发育的小孢子细胞壁表达出不育相关蛋白orf239,认为orf239序列的表达可能与转基因烟草的花粉败育直接相关。赵荣敏等学者将orf224部分编码序列及全长序列导入大肠杆菌,结果发现具有orf224特异表达产物特征的大肠杆菌生长减缓,推测orf224可能编码一个毒蛋白。在此研究水稻的不育情况利用的是orfH79基因,来研究水稻不育情况的形成途径。1.3线粒体基因与植物细胞质
15、雄性不育高等植物线粒体基因组尽管非常庞大,但所编码的功能基因有限。拟南芥线粒体因组DNA是至今唯一全序列测定的高等植物线粒体基因组,全长366924bp的DNA序列只编码57个基因。高等植物线粒体基因的编码序列保守性很强,而编码区以外的序列保守性很低,这个特点有利于利用已知基因研究其它各种植物线粒体基因的多态性变在植物线粒体中还DNA含有一些开放的阅读框架,它们能转录,但其功能和编码蛋白不清楚。这些阅读框有的是通过线粒体基因组重排而形成的嵌合基因;在不同植物中发现的近20个不同嵌合基因中有的与植物雄性不育性有关。1.3.1确定细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段的方法确定与细胞质雄性不育相关基
16、因或基因片段,可采用以下几种材料:1)不育系和保持系;2)不育系和育系的自发回复突变体;3)组培或原生质体融合分化产生的不育和可育植株。可以采用如下方法:1)用已知线粒体基因作探针对上述材料线粒体DNA进行RFLP分析或Northern分析,寻找二者间存在差异的基因;2)用限制性内切酶消化不育和正常胞质线粒体DNA,直接从分离胶上回收并克隆不育或正常 mtDNA特异片段;3)用AP-PCR、RAID或AFLP等方法比较正常和不育胞质线粒体DNA差异,克隆不育系特异的扩增片段;4)用差异展示的方法,寻找不育与正常胞质线粒体差异RNA。以上4种方法获得的差异片段可直接作为探针从线粒体DNA文库或e
17、DNA文库中筛选阳性克隆,进而确定与细胞质雄性不育有关的阅读框。1.3.2与细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段水稻BT-CMS不育系统的线粒体的DNA含两个atp6基因,而保持系只有一个。系列分析表明,不育系两个atp6基因中的一个与保持系完全一致,只是在终止子下游49位产生歧化。另一个atp6基因是一个嵌合基因,来源于线粒体DNA分子内重组,Kodoawki将它定名为urf-rmc。水稻野败型不育系和保持系除前述发现线粒体DNA酶切带谱有着差异。大多数小麦不育系来自于普通小麦和提莫菲维小麦的杂交后代,T-CMS小麦体细胞 培养再生不育和可育株atp6基因附近有差异;而T-CMS小麦不育系和
18、保持系coxl区域有差异,不育系coxl上游多一个orf256,估计不育系atp6基因区域以及orf256可能与T-CMS小麦不育性有关;另外,有人还发现T-CMS小麦不育系和保持系们rm5、rm8以及atpA也有差异。对于K-CMS和VCMS小麦李传友和王斌发现不育系和对应保持系atpA、atp9、cob基因附近有差异。而黑麦不育和正常胞质的atp6和coxl位点有差异。1.4 利用大肠杆菌研究植物细胞质雄性不育1.4.1 利用大肠杆菌研究过的CMS基因已有的研究表明一些经过转基因鉴定的引起植物细胞质雄性不育的基因,在原核生物中表达对其生长具有抑制作用。至今为止,在原核生物中CMS分子机理的
19、研究较深入的只有T型玉米细胞质不育基因urf13。Deway等将urf13基因导入大肠杆菌,发现urf13基因所编码蛋白能吸附在玉米线粒体内膜上,当大肠杆菌培养物中加入methomyl时,大肠杆菌的细胞膜通透性增加并膨胀,同时大肠杆菌的呼吸也受到抑制,最后导致细菌死亡;这种情况与T型玉米离体线粒体加入methomyl的表型类似。接着Korth在研究T型玉米时,发现URF13蛋白一部分与大肠杆菌线粒体内膜形成低聚状态同时在线粒体内膜上会形成穿孔。之后,在研究萝卜CMS基因orf138,芥菜CMS基因orf288,BT型水稻CMS基因orf79,向日葵CMS基因orf522时,CMS基因在原核生物
20、中的表达均能对大肠杆菌生长产生抑制作用。但CMS基因所编码蛋白在大肠杆菌中究竟如何抑制细菌生长的分子机理并没有进一步进行深入的研究。1.4.2 大肠杆菌与线粒体有类似的遗传体系1.4.2.1 细菌的内共生学说由美国生物学家马古利斯(LynnMargulis)于1970年出版的真核细胞的起源一书中正式提出。是关于真核生物细胞中的细胞器,线粒体和叶绿体起源的学说。根据这个学说,它们起源于内共生于真核生物细胞中的原核生物。这种理论认为线粒体起源于好氧性细菌(很可能是接近于立克次体的变形菌门细菌),而叶绿体源于内共生的光合自养原核生物蓝藻。这个理论的证据非常完整,目前已经被广泛接受。它的主要根据是:(
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