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免疫组化染色操作步骤.doc
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1、(完整版)免疫组化染色操作步骤免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学,是根据抗原-抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针,检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原-一抗二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法、亲和素生物素过氧化物酶(ABC)法和链霉亲和素-过氧化物酶(SP)法。PAP法一抗和二抗均不标记,避免了标记过程对抗体
2、活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体,与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物(含3个酶分子和2个抗体分子),染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本,最后用H2O2和二氨基联苯(DAB)为底物显示过氧化物酶,即可检测标本中的抗原成分。生物素为含硫的杂环单羧酸,可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合,从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白,与生物素有很高的亲合力,1分子亲合素可结合4分子生物素,ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合,制成ABC复合物,并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本
3、孵育过一抗和二抗后,再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。图1。 免疫组织化学基本原理示意图(引自八年制组织学与胚胎学)图2. SP法原理示意图SP法与ABC法相似,其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后,加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAB进行显色。与亲和素相比,链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低.SP法简化了操作步骤,同时也减少了非特异性背景,是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术.二、 实验准备:1。 标本准备石蜡包埋
4、组织切片:由病理室常规处理冰冻组织切片:由病理室常规处理细胞爬片:将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞,待细胞生长达到60以上后取出玻片,4多聚甲醛固定2 h.2. 试剂准备抗体选择单克隆抗体针对单一表位,具有较高的特异性,但在该表位破坏后将得不到阳性结果;多克隆抗体表位针对多个表位,可避免单克隆抗体的缺点,但是可能出现非特异性杂交。因此,不论选择单克隆还是多克隆抗体,最好同时购买两个货号的抗体,购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体,抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多,可选择文献上常用的经典抗体。二抗试剂盒目前本实验室所用二抗试剂盒为Life Technologies
5、HistostainPlus Kit (HRP, Broad Spectrum),货号85-9043,一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠.DAB试剂盒目前本实验室所用为加强型DAB显色试剂盒,货号DAB2032.其他试剂二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES胶3. 抗体特异性验证所有免疫组化抗体均须Western blot验证抗体特异性,并需免疫荧光实验验证抗原定位。4. 耗材准备免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片5。 溶液配制磷酸盐缓冲液(PBS)10PBS母液配制NaCl72 gNa2HPO412H2O37.3 gKH2PO44.3g加蒸馏水至1000 ml,充分混匀贮存
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