荧光发光原理.doc
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1、(完整word)荧光发光原理4.1 引言 某些物质被一定波长的光照射时,会在较短时间内发射出波长比入射光长的光,这种光就称为荧光。1852年, Stokes阐明了荧光发射的机制,认为荧光是由于物质吸收了光能而重新发出的波长不同的光,并由一种能发荧光的矿物 萤石(fluospar)而定名为荧光.我们通常所说的荧光,是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光,以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光,还有红外荧光、X射线荧光等.这不是本章要介绍的内容。荧光光谱有两个主要优点:第一是灵敏度高。由于荧光辐射的波长比激发光波长长,因此测量到的荧光频率与入射光
2、的频率不同.另外,由于荧光光谱是发射光谱,可以在与入射光成直角的方向上检测,这样,荧光不受来自激发光的本底的干扰,灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱。第二,荧光光谱可以检测一些紫外可见吸收光谱检测不到的过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁,荧光产生包括两个过程:吸收以及随之而来的发射.每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约1015秒),但两个过程中有一个时间延搁,大约为10-9秒,这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命,因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如,生色团及其环境的变化过程在紫外吸收的10-15秒的过
3、程中基本上是静止不变的,因此无法用紫外吸收光谱检测,但可以用荧光光谱检测。4。2基本概念和原理4.2。1荧光的产生 吸收外来光子后被激发到激发态的分子,可以通过多种途径丢失能量,回到基态,这种过程一般称为弛豫。在很多情况下,分子回到基态时,能量通过热量等形式散失到周围。但是在某些情况下,能量能以光子发射的形式释放出来。*Figure 5。3 Some pathways of relaxation from the excited state.*(P96) 上图(Campbell书中图5.3)表示了激发态分子的几种弛豫过程。由电子态基态被激发到第一电子激发态中各振动能级上的分子,一般会以某种形式
4、(统称为内转换)丢失它们的部分能量,从第一电子激发态的不同振动能级以至从第二电子激发态等更高的电子激发态返回第一电子激发态的最低振动能级。这个过程大约为10-12秒.从第一电子激发态的最低振动能级返回基态的不同振动能级,如果能量以光子形式释放,则放出的光称为荧光。这个过程通常发生在10-6-109秒内。由于荧光的频率低于入射光的频率,因此测量到的荧光频率与入射光的频率不同。同时,荧光是从与入射光成直角的方向上检测,这样荧光不受来自激发光的本底干扰,可以达到很高的灵敏度,一般比吸收光谱高两个数量级左右。此外,由于荧光有一定的寿命,且其寿命比紫外吸收的时间过程(1015秒)要长,因此一些用紫外观测
5、不到的变化过程(如生色团及其环境的变化),恰好可以用荧光来观测.在紫外吸收的时间过程(10-15秒)中,生色团及其环境基本上是静止不变的。而在很多反应中,溶剂的重新排列和分子的运动过程发生的时间与激发态的寿命是同一量级。4。2。2 磷光如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比荧光波长更长的波长的光,则称这种光为磷光.*Figure 5.3 Some pathways of relaxation from the excited state.*(P96)磷光产生的机制与荧光是不同的,虽然它们都属于发射光谱,但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的
6、结果,而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。所谓三重态或三线态,是指分子中电子自旋量子数S=1,即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变,以至电子自旋之和不为0的情况.处于第一电子激发态最低振动能级的分子,有可能通过无辐射跃迁(系间交连,intersystem crossing)消耗部分能量,其中一个电子的自旋方向倒转,从而处于三线态。从三线态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子,则其发光为磷光.由于三线态的电子自旋和不为零,这种跃迁是一种被禁跃迁,即跃迁几率很小。这样,在三线态停留的时间即寿命
7、就比较长(从103秒到数秒),强度很弱。由于三线态能量低于第一电子激发态最低振动能级,因此磷光的波长比荧光长。4.2.3 激发谱和发射谱 (参考书P94)荧光光谱包括激发谱和发射谱两种.激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况,也就是不同波长的激发光的相对效率;发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况,也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。激发谱既然是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化,而荧光的产生又与吸收有关,因此激发谱和吸收谱极为相似,呈正相关。由于激发态和基态有相似的振动能级分布,而且从
8、基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近,因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。Processes leading to fluorescence *Figure 5。2*(p94)在发射谱中最大荧光强度的位置称为lmax,它是荧光光谱的一个重要参数,对环境的极性和荧光团的运动很敏感。4。2.4 荧光寿命(fluorescence lifetime) 参考书p95去掉激发光后,分子的荧光强度降到激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间,称为荧光寿命,常用t表示: I t=I 0e-kt 其中I 0是激发时最大荧光强度,I
9、t是时间t时的荧光强度,k是衰减常数。假定在时t时测得的I t为I 0的1/e,则t是我们定义的荧光寿命。kt=1t=1/k即寿命t是衰减常数k的倒数.事实上,在瞬间激发后的某个时间,荧光强度达到最大值,然后荧光强度将按指数规律下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其1/e所需的时间都应等于t。如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量,则荧光寿命与荧光发射的速率常数成反比,速率常数即为单位时间中发射的光子数,因此有tF=1/KF。KF是速率常 数。tF表示荧光分子的固有荧光寿命,kF表示荧光发射过程的衰减常数.如果除荧光发射外还有其它释放能量的过程(如淬灭和能量转移),则寿命t还和这些过程的
10、速率常数有关,结果是荧光寿命降低。由于吸收几率与发射几率有关, tF与摩尔消光系数emax (单位为cm2mol-1或(mol dm-3) 1cm1)也就密切相关,从下式可以得到tF的粗略估计值(单位为秒)。1/tF104emax在讨论寿命时,必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数,而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间.通过量测寿命,可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。4。2.5 量子产率 (quantum yield) 参考书P96荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一,它表示物质发射荧光的本领。荧光量子产率通常用f来表示,定义为发射量子数和吸收量子数之
11、比,即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例,又称为荧光效率,即发射量子数f = 吸收量子数处于激发态的分子,除了通过发射荧光回到基态以外,还会通过一些其它过程回到基态.其结果是加快了激发态分子回到基态的过程(或称退激过程)。总的退激过程的速率常数k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示:k=kF+kiki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的寿命t为:t=1/k=1/(kF+ ki)因此,量子产率又可以表示为因为 1/kF=tF , t=1/(kF+ki)所以 f =t/tFf的绝对值是较难用实验的方法测量的,因为必须事先知道仪器的修正因子.实际测量中大多采用相对法,即用已知量
12、子产率的标准样品与待测样品进行比较.后面将要证明:对稀溶液来说,荧光强度F与吸收度A成正比:F=kI0Aj这里k是比例常数,I0是吸收前的光强度, f 是荧光量子产率。若两种溶液测量条件完全相同,则:F1/F2=A1f 1/(A2f 2)f 1/f 2=F1A2/(F2A1)已知f 2就可求出f 1。由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭(quenching),如温度淬灭,杂质淬灭等。量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改变必然会引起荧光强度的改变.因此,如果只要研究量子产率的相对值,只要量测荧光强度也就足够了。4。2。6 荧光强度:参考书P97荧光强度
13、F取决于激发态的初始分布IA与量子产率f的乘积。这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和,实际上,谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器测到的荧光强度=IAf Z,这里Z是仪器因子。椐据BeerLambert定律IA=I0It=I01-exp-2。3e (lA)Cl式中e (lA)为激发波长处的消光系数,为样品分子的浓度,I0为入射光强度,I0为透过样品后的光强度,l为光程(样品池光径)对于稀溶液,吸收很稀, e (lA)很小-2。3e (lA)Cl1因此,1-2.3e (lA)Clexp(-2。3e (lA)Cl)IA=I0(1-(12。3e (lA)Cl) =2。3I0e (lA)C
14、lF=IAfZ=2.3I0e (lA)CljZ如果激发光强保持不变,且j和Z与激发波长无关,则Fe (lA)很显然,荧光强度与样品在波度lA处的消光系数有关,而消光系数与激发波长是密切相关的,消光系数随波长的变化即吸收谱,因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱的正相关关系在此一目了然。当然,实际上仪器因子Z与波长是有关的,这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。4.2。7. 荧光偏振(偏振荧光,极化荧光) 参考书P98用平面极化光(偏振光)去激发一个荧光系统,可以产生极化荧光。可以通过对极化荧荧光的分析确定分子的大小,形状和流动性等性质。因此极化荧光分析在生物研究中是一种有力的手段。
15、Figure Tformat for polarization measurements。 DET, detector; G, gain. Subscripts refer to horizontal (H), vertical (V), perpendicular() and parallel(/).图 荧光偏振测量如图所示,假设沿z轴振动的平面极化光由x轴入射原点,在原点有荧光分子,受其激发后此分子发射极化荧光,在y轴收集极化荧光,令I为沿轴振动的极化荧光,令I为沿轴振动的极化荧光。定义极化率P=(I-I)/(I+I) =(IVVIVH)/(IVV+IVH)下标中的前,后两个字母分别表示入
16、射光和发射光的偏振方向,V(vertical)表示垂直,H(horizontal)表示水平,如其中IVH是指入射光偏振方向为垂直而发射光为水平时测得的荧光强度,其它如IVV也依此类推。荧光偏振是指物质在受激发时发射的荧光常为偏振光这样一种性质.从经典物理的观点来看,电子的跃迁相应于一个电偶极子的振动,其振动方向和电场变化方向一致时被激发发的几率最大,并随两者间夹角余弦的平方(COS2q)而变化。电偶极子发射的荧光在与电偶极子方向垂直的方向上最强(即荧光传播方向与电偶极子方向垂直的荧光最强),在与电偶极子平行的方向上最弱。溶液中的分子,其分布是随机的,而且从吸收到发射的时间之内,分子本身已经产生
17、了转动,因此荧光偏振的程度将减小,所以荧光偏振又常称为荧光消偏振或荧光去偏振。在分子朝向无规律但分子不能自由运动的溶液中,的值称为本征极化率P0。如果分子在激发态的寿命期间有一定的运动,则的值可能与P0不等。定义不对称度(或荧光各向异性) A=(I-I)/(I+2I)(I+2I)表示发射光的全部,包括平行于入射光方向上的以及与入射光轴垂直的两个方向上的分量。由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成分的敏感度可能不同,因而严格的测定需要引入校正因子G,G为水平偏振光激发样品时,仪器对垂直偏振光的透射效率与对水平偏振光透射效率之比,定义为G=IHV/IHH,IHV为起偏器水平取向而检偏器垂直
18、取向时测得的荧光强度,IHH为起偏器和检偏器均为水平取向时测得的荧光强度.仪器不同,波长不同,值都可能不同,应分别测定.经校正后的荧光偏振度=(IVV-GIVH)/(IVV+GIVH)经校正后的不对称度A=(IVV-GIVH)/(IVV+2GIVH)P和A的量测有时在稳态条件下进行,即采用恒定的光照。但有时也用毫微秒量级的偏振光脉冲来测量I和I的时间函数.这种技术常能测到一些其他的运动,是一种时间分辨的技术。4.2。8 天然荧光生色团和荧光探针(Natural fluorophores and fluorescent probes)参考书P99102生物化学中主要的荧光生色团可分为天然荧光生色
19、团和荧光指示剂(荧光探针)两类.天然的荧光生物分子只有芳香族氨基酸、核黄素、维生素A、叶绿素和NADH等少数分子,核酸中的碱基没有显著的荧光,只有tRNA中的Y碱基(二氢尿嘧啶)是个例外。在蛋白质的荧光谱中,由色氨酸残基发出的荧光占统治地位。Table 5.1AbsorptionFluorescenceSensitivityFluorophoreConditionslmax(nm)emax(10-3)lmax(nm)fFtF(ns)emaxfF(10-2)TrpH2O pH 72805。63480.202.611。TyrH2O pH 72741.4303O。13.61.4PheH20 pH 7
20、2570。22820.046。40.08Y-baseYeast t-RNAPhe3201。34600。076.30。91总的来说,天然的荧光生物分子种类很有限,而且荧光强度较弱,为了研究多数的不发光的生物分子,人们广泛利用一类能产生稳定荧光的分子,把这些小分子和大分子结合起来,或者插入大分子中,根据这些较小的荧光分子性质的改变,分析大分子的结构,这类小分子称为荧光探针。对于作为荧光探针的分子有以下几个基本要求:(1)能产生稳定的,较强的荧光。(2)探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合,而且结合得比较牢固.(3)探针的荧光必须对环境条件较敏感。(4)结合的探针不应影响被研究的大分子的结构
21、和特性。荧光探针种类很多。而且不断有人根据需要合成出新的探针。Campbell书图5.5列出了几种常用荧光探针的结构,书表5。2列举了一些典型的荧光探针的应用和基本性质(吸收波长,发射波长,灵敏度等)。参考书图5.5Table 5.2 Typical fluorescent probesaAbsorptionEmissionbSensitivityProbeUseslmax(nm)emax(103)lmax(nm)fFtF(ns)fFemax(10-2)Dansyl chlorideCovalent attachment to protein: Lys, Cys3303.45100.1133。
22、41,5IAEDANS3606。84800.515347Chloro-4-nitrobenzo-2-oxa1,3diazole(NBD)Lys, Tyr3459.5-1Fluorescein isothiocyanate(FITC)Covalent attachment to protein: Lys495425160。341168Anilino1naphthalene sulfortate(ANS)Noncovalent binding to proteins3746。84540。981667Pyrene and various derivativesPolarization studies
23、 in membranes342403830.25100100Ethenoadenosine and various derivativesAnalogues of nucleotides bind to proteins。 Incorporate into nucleic acids3002.64100。402610Ethidium bromideNoncovalent binding to nucleic acids5153。8600126。538Proflavine monosemicarbazideCovalent attachment to RNA 3ends445155160.02
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