基于网络药理学和生物信息学探讨满药复方木鸡颗粒治疗肝癌的分子机制.pdf
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1、食品与生物工程基于网络药理学和生物信息学探讨满药复方木鸡颗粒治疗肝癌的分子机制柯昌虎1,2,严慧1,陈春晓2,李志浩1,朱军1,李鹏1,2*(1.湖北医药学院附属国药东风总医院,湖北十堰442008;2.湖北医药学院药学院,湖北十堰442000)摘要:利用网络药理学和生物信息学方法揭示复方木鸡颗粒治疗肝癌的作用机制。通过TCMSP、SwissTargetPrediction 数据库分别获取复方木鸡颗粒的活性成分以及相关靶点;在 GEO 数据库筛选肝癌的相关靶点;利用 Venny2.1 在线平台获取药物与疾病的共同靶点;由 Cytoscape3.8.2 绘制药物成分靶点疾病网络;用 STRING
2、 数据库构建 PPI 网络;通过 DAVID 数据库进行GO 功能富集和 KEGG 通路富集分析;利用 KaplanMeier-Plotter 数据库对关键基因的表达量及预后关联性进行分析;运用 AutoDock 软件对关键成分和靶点进行分子对接验证。复方木鸡颗粒中共获得 37 个活性成分,筛选出 57 个共有靶点,涉及生物过程 98 条、细胞成分 17 条、分子功能 37 条,介导 15 条信号通路。生存期分析结果显示,ESR1、CYP3A4、G6PD 基因的表达量与肝癌患者的生存期具有相关性。分子对接表明筛选的 6 个活性成分与 6 个关键靶点蛋白之间具有较好的结合能力。复方木鸡颗粒中的大
3、豆皂苷 C、柚皮素、-谷固醇、汉黄芩素等活性成分可以作用于 ESR1、CYP3A4、G6PD 等靶点,可能通过 P53、戊糖磷酸途径、MAPK 等信号通路发挥治疗肝癌的作用。关键词:复方木鸡颗粒;肝癌;网络药理学;生物信息学;分子对接;作用机制中图分类号:R285.5文献标志码:A文章编号:1673159X(2024)02009314doi:10.12198/j.issn.1673159X.4741StudyonMechanismofCompoundMujiGranuleofManchuMedicineintheTreatmentofLiverCancerBasedonNetworkPharm
4、acologyandBioinformaticsKEChanghu1,2,YANHui1,CHENChunxiao2,LIZhihao1,ZHUJun1,LIPeng1,2*(1.Sinopharm Dongfeng General Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008 China;2.School of Pharmacy,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000 China)收稿日期:20230904基金项目:湖北省卫生健康委面上项目(WJ2021M062);“十四五”湖北省高等学校
5、优势特色学科群(生物与医药)资助项目(2022BMXKQT6);武当特色中药研究湖北省重点实验室开放课题(WDCM2022012);十堰市科技局科研项目(22Y79)。第一作者:柯昌虎(1987),男,硕士,副主任药师,主要研究方向为中药活性成分与质量控制。ORCID:0000000273772138E-mail:KCHDFZYY*通信作者:李鹏(1968),男,博士,副教授,主任药师,主要研究方向为中药药效物质基础。ORCID:0000000162730517E-mail:引用格式:柯昌虎,严慧,陈春晓,等.基于网络药理学和生物信息学探讨满药复方木鸡颗粒治疗肝癌的分子机制J.西华大学学报(自
6、然科学版),2024,43(2):93106.KEChanghu,YANHui,CHENChunxiao,etal.StudyonMechanismofCompoundMujiGranuleofManchuMedicineintheTreatmentofLiverCancerBasedonNetworkPharmacologyandBioinformaticsJ.JournalofXihuaUniversity(NaturalScienceEdition),2024,43(2):93106.第 43卷第 2 期西华大学学报(自然科学版)2024年3月Vol.43,No.2JournalofXi
7、huaUniversity(NaturalScienceEdition)Mar.2024Abstract:Methodsofnetworkpharmacologyandbioinformaticswereutilizedtopredictthemechan-ismofcompoundMujigranuleofManchumedicineinthetreatmentoflivercancer.TheactiveingredientsandcorrespondingtargetsofcompoundMujigranulewerecollectedbyTCMSPandSwissTargetPredi
8、c-tiondatabase.TherelatedtargetsoflivercancerwerescreenedthroughtheGEOdatabase.Venny2.1on-linesoftwarewasusedtoobtainthecommontargetsofdrugs-disease,andthenthe“drug-compound-target-disease”networkdiagramwasconstructedbyusingthesoftwareCytoscape3.8.2.TheSTRINGdatabasewasusedtodrawtheprotein-proteinin
9、teractionnetwork,andtheperformGOfunctionandKEGGpath-wayenrichmentanalysiswerecarriedoutthroughDAVIDdatabase.Therelationshipbetweentheexpres-sionofkeytargetgenesandthesurvivalcurvewasanalyzedbyusingtheKaplanMeier-Plotterdatabase,andtheAutoDockplatformwasappliedinverifyingthemoleculardockingofactiveco
10、mponentsandcoreproteintargets.Atotalof37activecomponentswereobtainedfromcompoundMujigranule,and57com-montargetswerescreened,involving98biologicalprocesses,17cellularcomponents,37molecularfunc-tions,and15signalpathways.TheresultsofsurvivalcurveanalysisshowthattheexpressionlevelsofESR1,CYP3A4,andG6PDw
11、ererelatedtothesurvivaltimeoflivercancerpatients.Itwasindicatedthat6activecomponentsand6keytargetshadacertaindegreeofbindingthroughmoleculardocking.TheactivecompoundsincompoundMujigranule,subprogeninC,naringenin,beta-sitosterolandwogonin,canactontargetssuchasESR1,CYP3A4andG6PD,whichmayplayatherapeut
12、icroleinlivercancerbyregulatingp53,pentosephosphate,MAPKandothersignalingpathways.Keywords:compound Muji granule;liver cancer;network pharmacology;bioinformatics;moleculardocking;mechanismofaction肝癌是一种高发致命的肿瘤,已经成为全人类面临的公共健康问题。2020 年我国新发肝癌患者占全球 45%,死于肝癌的患者达到 39 万,新发病例和死亡病例均位居世界前列,防控形势严峻1。目前仅有不到 15%的早
13、期患者符合手术切除的条件,肝癌术后 5 年的复发率高达 70%,5 年的生存率在50%左右1。放疗、化疗等治疗选择有较多的副作用且容易引起全身毒性,口服药物耐药性明显,肝癌患者的预后不佳2。中药具有减毒增效的作用,可以增强免疫力,提高患者生存质量,适用于整个临床治疗过程,在肝癌治疗方面凸显出巨大潜力3。复方木鸡颗粒源于满族民间验方“木鸡汤”,由云芝、核桃楸皮、山豆根和菟丝子 4 味中药组成,其中云芝能够健脾除湿、养肝散结,核桃楸皮和山豆根具有清热解毒、散结的作用,菟丝子具有保肝明目的功效。药理实验研究发现,复方木鸡颗粒可以抑制 SMMC-7721、HepG2 肝癌细胞增殖并促使细胞凋亡,且与顺
14、铂联用可以获得协同增效作用4-5。现代临床研究6显示,复方木鸡颗粒可以明显抑制甲胎蛋白的升高,对肝癌、肝硬化等各种肝脏疾病均具有显著的治疗效果。复方木鸡颗粒被广泛用于肝癌治疗,但是其所含成分复杂,治疗肝癌的分子作用机制尚未明确。网络药理学将药物、靶点和疾病三者结合起来,从整体水平反映出中药干预疾病的机制7,具有系统性、相关性和预测性的特点,从而为阐明药物作用机制提供支持8,与生物信息学联合应用于各种疾病的研究。分子对接借助计算机模拟活性分子和靶点蛋白的相互作用,结合网络药理学成为解释中药的药效基础和治疗分子内在机制的可行途径9。本研究利用网络药理学结合生物信息学的方法,筛选复方木鸡颗粒治疗肝癌
15、的成分及靶点,构建蛋白相互作网络和“药物成分靶点疾病”网络,进行靶点的功能富集和通路富集分析以及关键基因对肝癌生存预后的影响分析,并应用分子对接技术进行验证,进而探讨其可能的药效物质基础和分子机制,从而为复方木鸡颗粒治疗肝癌的深入研究和临床应用提供依据,具体实验流程见图 1。94西华大学学报(自然科学版)2024年云芝山豆根菟丝子核桃揪皮TCMSPLITERATUREActive components ofCompound Muji GranulePubhemSwissTargetPredictionComponent target ofCompound Muji Granule肝癌图1实验流
16、程图Fig.1Experimentalflowchart1资料与方法1.1数据库及软件本研究中所使用的数据库和软件工具,如表 1所示。1.2复方木鸡颗粒活性成分及作用靶点的筛选从 TCMSP 数据库中查找云芝、山豆根和菟丝子 3 味中药的化学成分,经文献检索获取核桃楸皮的化学成分,筛选同时满足口服生物利用度(oralbioavailability,OB)30%和类药性(drug-likeness,DL)0.18 两项指标的所有活性成分10。在PubChem数据库获取成分的 SMILES 格式,将其导入 SwissTargetPrediction 数据库中得到成分的靶点,选取Probabilit
17、y 大于 0 的靶点。表1数据库及软件Tab.1Databaseandsoftware名称网址用途TCMSPhttp:/ GEO 数据库中下载基因芯片 GSE60502。通过 GEO2R 功能来对选择的基因数据集进行分析处理,以 P0.05 且|logFC|1.5 为标准筛选出肝癌中的差异表达基因,并绘制火山图。在 GEO 数据库中下载基因系列矩阵文件,通过 Excel 的 LOOKUP 函数获取差异表达基因在样本中的表达量,将排名前 40 的差异表达基因绘制热图。1.4共有靶点的获取将肝癌靶点和复方木鸡颗粒靶点导入Venny2.1.0在线平台,进行交集匹配,获得复方木鸡颗粒与肝癌的共有靶点,
18、并制作韦恩图。1.5药物成分疾病靶点网络构建使用 Cytoscape3.8.2 软件上传成分及靶点信息,构建“药物成分疾病靶点”相互作用网络,以 degree 值为拓扑指标,使用软件中 NetworkAnalyzer 功能进行网络分析。1.6蛋白互作网络的构建在 STRING 数据库中上传共有靶点,设置Organism 类型为“Homosapiens”,选择交互作用大于 0.15 的 靶 点,在 Cytoscape3.8.2 软 件 中 导 入TSV 格式文件,构建蛋白质相互作用(protein-proteininteraction,PPI)可视化网络。1.7功能和通路富集分析借 助 DAVI
19、D 数 据 库 进 行 基 因 本 体(geneontology,GO)功能富集与京都基因和基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgnomes,KEGG)通路富集分析,限定物种为“Homosapiens”。以P0.05 为阈值进行筛选,探讨复方木鸡颗粒治疗肝癌的生物学过程和信号通路。1.8关键基因的表达量及预后关联性分析使用 KaplanMeier-Plotter 在线软件对复方木鸡颗粒作用于肝癌的核心基因表达情况与肝癌患者预后情况进行分析,筛选条件为 livercancerRNA-seq;Survival:OS(n=364),并绘制生存曲线。1.9分子对接验证
20、在 PubChem 数据库中查找成分结构,借助OpenBabel 软件将成分的文件格式由 sdf 转化为mol2。从 PDB 数据库中获取蛋白的三维结构,运用 PyMOL 软件对其进行除水等操作步骤,将其保存为 pdb 文件格式。使用 AutoDock 软件将蛋白和活性成分进行分子对接,再使用 PyMOL 软件对成分蛋白对接结果进行可视化分析。结合能小于0,则表明药物分子和受体蛋白可以自发结合,结合能越低则形成的复合物越稳定。2结果2.1复方木鸡颗粒主要活性成分及作用靶点从 TCMSP 数据库中共检索到 235 个有效成分,其中云芝 32 个,山豆根 79 个,菟丝子 29 个,从文献中获取到
21、 95 个核桃楸皮的有效成分。进行成分筛选去重后,共得到 37 个复方木鸡颗粒活性成分(见表 2),其中 beta-sitosterol 是云芝、菟丝子和核桃楸皮的共有成分,formononetin 是山豆根和核桃楸皮的共有成分,isorhamnetin、matrine 是山豆根和菟丝子的共有成分,kaempferol、quercetin 是山豆根、菟丝子和核桃楸皮的共有成分。通过 SwissTargetPrediction 数据库共得到 599 个靶点。2.2肝癌差异表达基因通过 GEO 数据库下载基因芯片 GSE60502 的基因表达谱数据,其中包括 18 个正常样本和 18 个肝癌样本。
22、利用 GEO2R 功能对所有样本进行分析,经筛选共得到 685 个肝癌差异表达基因,其中上调基因 359 个、下调基因 326 个。如图 2 所示,火山图中红色点、绿色点和灰色点分别代表上调基因、下调基因、差异表达不显著基因。将前40 个差异表达的基因绘制热图(见图 3),红色、蓝色分别代表基因表达水平上升与下降,结果表明正常组和肝癌组的基因表达谱具有差异性。2.3药物疾病共有靶点的筛选将 599 个成分靶点与 685 个肝癌靶点分别导入 Venny 在线平台进行匹配,绘制韦恩图,如图 4 所示,得到二者共有靶点 57 个,即为复方木鸡颗粒治疗肝癌的作用靶点。2.4药物成分靶点疾病网络构建在
23、Cytoscape3.8.2 软件中绘制“药物成分靶点疾病”相互作用的网络图,见图 5。共有 98 个节点和 326 条边,其中橙色四边形、红色倒三角96西华大学学报(自然科学版)2024年表2复方木鸡颗粒的活性成分信息Tab.2InformationonactiveingredientsofcompoundMujigranules编号MolID化合物OB/%DL来源1MOL0128205-Uridylicacid40.250.20云芝2MOL000358beta-sitosterol36.910.75云芝、菟丝子、核桃楸皮3MOL012816ergosterolperoxide42.840.
24、74云芝4MOL0036514aR,6aR,6aS,6bR,8aR,9S,10S,12aR,14bS)-10-hydroxy-2,2,4a,6a,6b,9,12a-heptamethyl-9-methylol-3,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-dodecahydro-1H-picen-4-one37.640.75山豆根5MOL0036753,4,5,6-tetradehydrospartein-2-one71.260.24山豆根6MOL003629Daidzein-4,7-diglucoside47.270.67山豆根7MOL000392formononetin6
25、9.670.21山豆根、核桃楸皮8MOL003648Inermin65.830.54山豆根9MOL001484Inermine75.180.54山豆根10MOL005440Isofucosterol43.780.76山豆根11MOL000354isorhamnetin49.600.31山豆根、菟丝子12MOL000422kaempferol41.880.24山豆根、菟丝子、核桃楸皮13MOL003656Lupiwighteone51.640.37山豆根14MOL005944matrine63.770.25山豆根、菟丝子15MOL003633Oxynarcotine56.740.60山豆根16M
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