内蒙古乌拉特中旗传统乳制品中乳酸菌的分离鉴定.doc
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1、 本科毕业论文内蒙古乌拉特中旗传统乳制品中乳酸菌的分离鉴定学 院:食品科学与工程专 业:食品科学与工程学 号:110910787姓 名:张永亮指导教师:孟和毕力格职 称:教 授论文提交日期:二一五年六月 摘 要传统乳制品是乳酸菌的天然栖息环境,为了认识和研究干旱半荒漠地区传统乳制品中乳酸菌菌群结构,并分离保藏该乳酸菌资源,以采自内蒙古乌拉特中旗的35份传统乳制品样品(19份酸牛奶,7份奶油,2份奶酪,7份鲜牛奶)为研究对象,运用纯培养技术和16S rRNA基因序列分析方法对样品中乳酸菌进行分离鉴定。结果显示:从35份样品中共分离获得属于12个种和亚种的124株乳酸菌,即Lac. lactis
2、subsp. lactis(48株,占分离株38.71%)、L. plantarum(32株,占25.81%)、Leu. mesenteroides(22株,占17.74%)、L. paracasei(6株,占4.84%)、L. helveticus(5株,占4.03%)、L. rhamnosus(3株,占2.42%)和L. brevis、L. diolivorans各2株(分别占1.61%),且Leu. pseudomesenteroide、E. durans、E. sulfurous、L. buchneri各1株(分别占0.81%)。其中以Lac. lactis subsp. lactis
3、和L. plantarum为样品中优势菌群,其次Leu. mesenteroides和L. paracasei的分离数量较多。关 键 词:传统乳制品;乳酸菌;分离鉴定Isolation and identification of Latic acid bacteria from traditional dairy products in Wulate ZhongqiAbstractTraditional dairy products were the natural habitats of lactic acid bacteria. In order to reveal and researc
4、h the population structure of lactic acid bacteria, and preserve lactic acid bacteria from traditional dairy products in arid and desert areas. Lactic acid bacteria were isolated and identified using pure culture method and 16S rRNA gene sequencing from sixty nine samples of traditional dairy produc
5、ts, including yogurt, cream, cheese and milk, which were collected from pastoral of Wulate Zhongqi areas of Inner Mongolia.The results showed as follows: 124 isolates from 35 samples of Wulate Zhongqi of Inner Mongolia were identified into 12 species or subspecies, including Lac. lactis subsp. lacti
6、s (48 strains, account for 38.71% of the total isolate), L. plantarum (32 strains, account for 25.81%), Leu. mesenteroides (22 strains, account for 17.74%), L. paracasei (6 strains, account for 4.84%), L. helveticus (5 strains, account for 4.03%), L. rhamnosus (3 strains, account for 2.42%) and L. b
7、revis, L. diolivorans (2 strains, account for 1.61% respectively) and Leu. pseudomesenteroide、E. durans、E. sulfurous、L. buchneri (1 strains, account for 0.81% respectively). Lac. lactis subsp. lactis and L. plantarum were the predominant species of samples, the second are Leu. mesenteroides and L. p
8、aracasei.Key words: Traditional dairy products; Lactic acid bacteria; Isolation identification 目 录1 引言11.1 乳酸菌概述11.1.1 乳酸菌11.1.2 乳酸菌的益生作用11.2 乳酸菌的分类鉴定方法11.2.1 传统鉴定方法21.2.2 分子生物学方法21.3 研究内容22 材料与方法32.1 材料32.1.1 样品来源32.1.2 试验试剂32.1.3 仪器与设备42.2 方法52.2.1 样品采集52.2.2 乳酸菌组成分析52.2.3 乳酸菌的分离纯化及保存52.2.4 16S rR
9、NA基因序列同源性分析63 结果与分析83.1 传统乳制品中乳酸菌组成分析83.2 传统乳制品中乳酸菌的分离结果93.3 乳酸菌16S rRNA基因序列同源性鉴定结果93.3.1 分离株基因组DNA提取结果93.3.2 乳酸菌16S rRNA 扩增的电泳结果103.3.3 测序结果及系统发育树的构建114 结论13致 谢14参 考 文 献15个 人 简 介1719内蒙古农业大学学士学位论文1 引言1.1 乳酸菌概述1.1.1 乳酸菌 乳酸菌是一种能够在可运用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌,它的特征是:革兰氏染色呈阳性,过氧化氢酶呈阴性,无芽孢,很少运动或无运动性,发酵糖类产生50%
10、以上乳酸,低氧环境中适宜生长,分解蛋白质和脂肪能力较弱,产酸能力强1。乳酸菌广泛分布于人体、动物、植物和整个自然界,如存在于乳制品、肉制品、蔬菜等食品,也有部分栖居于人类及其他哺乳动物的口腔和肠道等环境中,在土壤、湖泊、动物饲料中也发现了乳酸菌的存在2,3。1.1.2 乳酸菌的益生作用乳酸菌是发酵乳制品(益生菌酸奶、发酵乳饮料、干酪和发酵奶油)生产当中必不可少的菌种,其独特的生物学功能使乳酸菌在工农业、食品及医疗保健等领域中有了很高的应用价值4。乳酸菌发酵糖类物质产生的主要代谢产物乳酸可以使产品pH值降低,达到抑制腐败菌的目的,从而提高产品的营养价值及保藏性;此外乙醛、双乙酰等代谢产物赋予发酵
11、乳独特的风味和质地,从而改善产品风味5。目前,随着人们对肠道菌群研究的不断深入,发现乳酸菌作为人体肠道中重要的生理菌群与机体健康息息相关。具有维持人体内微生态平衡、增强人的免疫功能、预防胃肠道疾病、阻止致病菌定殖、提高营养利用率、控制内毒素、延缓机体衰老、促进营养吸收、降低胆固醇水平等诸多有益于人体健康的益生作用6。临床应用上,乳酸菌可以作为益生菌预防和治疗腹泻,且能提高乳糖不耐者对于乳糖的消化及利用。此外,乳酸菌在过敏性反应和结肠炎性疾病的预防和治疗方面也具有重要作用7。1.2 乳酸菌的分类鉴定方法1.2.1 传统鉴定方法传统的分类方法主要依据菌株的菌落形态特征,生理生化特性和代谢产物等表面
12、特征对乳酸菌进行鉴定8,通常对微生物在培养基上形成的生长状态和菌落形态进行观察,并且在显微镜底下对个体形态进行研究,观察菌体细胞形态、大小和排列方式,还通过乳酸脱氢酶试验,葡萄糖产气试验,耐酸碱生长试验等方面进行鉴定。在过去的那些年,Orla-Jensen 根据菌株的菌株生理生化特性以及菌落特形态特征等指标,能够把属于乳杆菌属内的菌种再细分为三个亚属,即Thermobacterium、Streptobacterium 和 Betabacterium9。传统分类法可以对乳酸菌分类鉴定,但是这种表型特征法有一定的局限性,因为仅依靠菌株的特征很难分辨生理生化特性极其相似的菌株,又不能准确的说明乳酸菌
13、菌群结构,不能表示菌株基因亲缘关系10。 1.2.2 分子生物学方法近年来,现代生物科学技术的飞速发展促进了分子生物学技术在乳酸菌分类鉴定研究领域中的应用。核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)基因被人们认为是衡量生命进化历史最理想的标尺,其在细菌的进化过程中相对保守,素有“细菌石”之称11。原核生物的三种核糖体亚基中,16S rRNA含有1540个核苷酸,其大小适中便于序列分析,同时具有高度保守性和高变性。其保守性反映生物物种间的亲缘关系,作为分析系统发育树的重要依据;高变性揭示生物物种的特征核苷酸序列,具有着株、种、属的结构特征,细菌种属鉴定的分子基础12。因此,16S rR
14、NA基因成为黄金标准,在细菌的分类、鉴定中被广泛的应用。16S rRNA基因序列分析技术的基本原理是基于纯培养技术从微生物细胞中提取基因组DNA,采用细菌16S rRNA基因通用引物对16S rRNA基因片段进行扩增,并通过测定扩增产物,获得核苷酸序列,将其提交到GenBank数据库,采用Blast软件与已知序列进行比对,从而可以确定微生物的所属物种。16S rRNA 基因序列分析技术作为细菌分子生物学鉴定方法之一,已被广泛应用于细菌的分类、鉴定研究中。孙天松,刘红霞13等对发酵酸驼乳中乳酸菌和酵母进行了分离,并采用16S rRNA基因序列分析方法对分离株进行分类鉴定,从而确定为干酪乳杆菌是样
15、品中优势菌群。赵蕊、霍贵成14等采用传统分类与16S RNA基因序列测定结合的方法对从新疆酸奶中分离到的乳酸菌进行了鉴定。Randa15用传统方法、RFLP和16S rRNA基因序列分析方法对绿橄榄中的乳酸菌进行了研究,结果发现,传统方法鉴定其中24株为干酪乳杆菌,13株为短乳杆菌,其余的11株为植物乳杆菌,而16S rRNA基因序列分析方法则表明大多数为干酪乳杆菌。Jassim16采用16S rRNA基因序列分析方法方法鉴定了13株分离自健康猪小肠、直肠和盲肠中的细菌,结果发现8株为瘤胃乳杆,2株为粪肠球菌。1.3 研究内容本试验采用纯培养技术和形态学观察,对采集于内蒙古乌拉特中旗的35份传
16、统乳制品样品(发酵酸奶、奶油、奶酪和鲜奶)进行乳酸菌分离,并运用16S rRNA基因序列分析方法对革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的乳酸菌分离株进行分类鉴定。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 样品来源本试验所用的35份传统乳制品样品采集于内蒙古乌拉特中旗。具体的采样地点见图1。图1传统乳制品采集地点Fig. 1 Collecting site of traditional dairy products 注:为采样地点2.1.2 试验试剂试验中所用试剂配制所需的药品全部都是购自大连宝生物技术有限责任公司,都是内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供,具体如表1所示。表1 主要试剂列表T
17、abel.1 Material list试剂名称配制或来源MRS固体培养基(288210,美国BD公司)无锡赛维技术有限公司MRS液体培养基(CM0359,英国OXOID公司)上海汉尼生物技术有限公司M17固体培养基(CM0785B,英国OXOID公司)上海汉尼生物技术有限公司M17液体培养基(CM0817B,英国OXOID公司)上海汉尼生物技术有限公司10%脱脂乳保护剂参考文献17配制0.5M EDTA 参考文献17配制10TE缓冲液(pH 8.0)参考文献17配制10% SDS参考文献17配制10M CTAB参考文献17配制酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,V/V)参考文献17配制5M N
18、aCl参考文献17配制氯仿/异戊醇(24:1,V/V)参考文献17配制3M NaAc,参考文献17配制5TBE电泳缓冲液贮液参考文献17配制dNTPs (每种2.5 mM)大连宝生物技术有限公司10EasyTaq Buffer大连宝生物技术有限公司EasyTaq DNA polymerase (5 U/L)大连宝生物技术有限公司核酸染料GELVIEW大连宝生物技术有限公司DL 2000 DNA Marker大连宝生物技术有限公司6DNA Loading Buffer大连宝生物技术有限公司2.1.3 仪器与设备表2 试验所用的主要仪器以及设备Table.2 Main equipments use
19、d in study仪器名称仪器型号仪器制造厂垂直流超净工作台ZHJH-1214B上海智城分析仪器制造有限公司电热恒温培养箱DHP- 9272上海一恒科技有限责任公司光学显微镜BX50日本奥林巴斯(OLYMPUS)全自动高压蒸汽灭菌器HA-300M日本HIRAYAMA公司游祸振荡器Vortex-genie2美国 Scientific Industries 公司厌氧培养罐AG0035A英国OXOID公司台式大容量高速冷冻离心机5810R德国Eppemlorf公司全自动高压干热灭菌器SP-650日本三洋电器集团(SANYO)真空冷冻干燥机LL-6SFPY美国LABCONCO公司低速离心机KDC-1
20、044安敏中科中佳科学仪器有限公司微量紫外分光光度计ND-1000美国NanoDrop公司电热恒温水浴锅HWS-28上海一恒科技有限公司PCR热循环仪9902美国Applied Bio砂stems公司凝胶成像系统GDS-8000美国UVP公司多用途水平电泳槽BG-subMIDI北京百晶生物技术有限公司水平摇床WD-9405B北京市六一仪器厂沃德生物医学仪器公司电泳仪DYY-12北京市六一仪器厂2.2 方法2.2.1 样品采集吸取1.5mL样品放进装有0.5g 灭菌中和剂(淀粉/CaCO3,50:1,M/M)的无菌冻存管之中,混合均匀;采集固体样品时,用灭菌勺取5g左右样品装入无菌冻存管中。标记
21、样品号,用封口膜封口,放入4便携式冰箱,低温储存。将样品带回实验室里,进行微生物组成分分析以及乳酸菌的分离试验。2.2.2 乳酸菌组成分析 吸取0.5mL充分混匀的液体样品或称取0.5g固体样品,移至4.5mL 的灭菌生理盐水(0.85%,w/v)充分混匀,采用十倍梯度稀释法进行稀释,选取稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液,分别吸取1mL于无菌培养皿中,将灭完菌处于保温状态的培养基(约20mL)倒入平皿中,小心旋转平皿,混匀。待平板中培养基完全凝固后,移置厌氧培养罐中(气体条件:CO2:H2:N2= 10:10:80)30培养4872h,用于乳酸菌计数。2.2.3 乳酸菌的分离纯化及
22、保存分别从2.2.2制备的稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液中吸取200L置于预先制备的MRS和M17固体平板培养基上,均匀涂布。之后将平皿置于厌氧培养罐中,30 培养4872h,待菌落形成后,观察菌落形态,编号,做记录。用无菌接种环挑取已标记的单个特征菌落对应接种于MRS或M17液体培养基中,30条件下厌氧培养24h。生长良好的一代菌株被用于革兰氏染色试验(涂片、固定、染色、脱色),并镜检后将革兰氏阳性纯培养物的菌株划线接种于MRS或M17固体培养基。镜检后将细胞形态特征、排列方式不一致的菌株继续划线接种于MRS或M17固体培养基,进行纯化试验。最后将革兰氏染色试验呈阳性、过氧化氢
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