基于网络药理学和分子对接技术探讨三草保肝汤抗肝癌作用机制.pdf
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1、Vol.50No.2Journal of SouthvstMinzuUniversity(Natural ScienceEdition)we第50 卷第2 期Mar.2024西南民族大自然科学版)2024年3月doi:10.11920/xnmdzk.2024.02.006基于网络药理学和分子对接技术探讨三草保肝汤抗肝癌作用机制李慧,李亚南,周俊福,王玉娟?,代鑫燕”,沈立都,严亨秀(1.西南民族大学药学院,四川成都6 10 0 41;2.西南民族大学青藏高原研究院,四川成都6 10 0 41)摘要:利用网络药理学和分子对接技术,研究三草保肝汤(SancaoBaogandecoction,SBD
2、)治疗肝癌的物质基础及其可能的作用机制.利用TCMSP数据库获取SBD的药材成分信息;利用TCMSP、Sw i s s t a r g e t p r e d i c t i o n、G e n e Ca r d s、O M IM 数据库得到药物和肝癌靶点;R语言统计得到SBD和肝癌靶点的交集,交集导入STRING平台绘制PPI网络,筛选核心靶点;利用Cytoscape构建“三草保肝汤-活性成分-潜在靶点”和“关键靶点-活性成分”互作网络,筛选主要成分;利用Metascape数据库对共有靶点进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KECG)富集分析;分子对接验证活性成分与靶点.Wers
3、ternblot实验验证三草保肝汤作用肝癌细胞的核心靶点.结果发现,SBD4种主要活性成分为木犀草素、花酸、山奈酚和皮素;SBD可通过多成分、多靶点、多通路发挥抗肝癌作用,其中,AKT1、M A PK 3是抑制肝癌的重要艳点.关键词:三草保肝汤;肝癌;网络药理;分子对接;AKT1;MAPK3中图分类号:R285文献标志码:A文章编号:2 0 95-42 7 1(2 0 2 4)0 2-0 157-10Research on the mechanism of Sancao Baogan decoction in treating hepatocellularcarcinoma based on
4、network pharmacology and molecular dockingLI Hui,LI Ya-nan,ZHOU Jun-fu,WANG Yu-juan?,DAI Xin-yan?,SHEN Li-du,YAN Heng-xiu(1.School of Pharmacy,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China;2.Qinghai-Tibet Plateau Research Institute,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China)Abstract:Network p
5、harmacology and molecular docking technology were used to study the material basis and possible mecha-nism of Sancao Baogan decoction(SBD)in treatment of hepatocellular carcinoma(HCC).TCMSP database and reports wereused to obtain the ingredients of SBD.TCMSP,Swiss target prediction,GeneCards,and OMI
6、M databases were used to obtaindrug and HCC related disease targets.R language statistics resulted in the intersection of SBD and hepatocellular carcinoma tar-gets,which was imported into the STRING platform to construct protein-protein interaction(PPI)network and screen the coretargets.Cytoscape wa
7、s used to construct“Sancao Baogan Decoction-active components-potentialtargets”and“key targets-activecomponents interactions networks,and screen the main components.The geneontology(GO)and Kyoto encyclopedia of genesand genomes(KEGG)pathways involved in the targets were analyzed by Metascape databas
8、e.Molecular docking to validate theinteraction between active components and targets.Western blot experiments was carried out to confirm the core targets of San-cao Baogan Decoction on liver cancer cells.The results showed that the four main active ingredients of SBD were luteolin,ellagicacid,kaempf
9、erol,and quercetin;SBD could exert its anti-hepatocellular carcinoma effects through multiple components,multipletargets,and multiple pathways,among which AKT1 and MAPK3 were important targets for inhibiting hepatocellular carcinoma.Keywords:Sancao Baogan decoction;hepatocellular carcinoma;network p
10、harmacology;molecular docking;AKT1;MAPK3收稿日期:2 0 2 3-0 9-0 7通信作者:严亨秀(197 1-),女,教授,博士,研究方向:中药免疫学.E-mail:y h x 0 0 3 s w u n.e d u.c n基金项目:四川省科技厅项目(2 0 2 1YJ0256);西南民族大学2 0 2 2 年研究生创新型科研项目(ZD2022580)158第50 卷西南民族大学自然科学版)肝癌是世界范围内的常见恶性肿瘤,,在我国恶性肿瘤中肝癌的发病率与死亡率分别排位于第四位与第二位,严重影响国民健康 1-2 .中医认为肝癌由湿毒人侵、脾失健运等原因导致
11、,早期防治有助于抑制肝癌的发展和转移.三草保肝汤是来源于民间具有保肝降酶作用的常用验方,由夏枯草、金钱草、车前草等3味中药材组成,具有化湿和中、清热泻火、软中散结、利水消肿的作用.临床用药过程中,SBD治疗肝炎、肝癌等疾病具有显著疗效.本课题组从SBD中鉴定出40 个化学成分,包括酚酸类、黄酮类、葱醌类、三类等 3,其中木犀草素、花酸等化合物均具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用 45.SBD成分多样,疾病治疗靶点多,导致其作用机制不明确.网络药理学通过整合系统生物学、高通量筛选、网络分析以及网络可视化等多种技术,揭示“疾病-基因-靶点-中药”相互作用的复杂体系,有利于于系统性分析中药对机体
12、疾病的干预与影响.因此采用网络药理、分子对接分析SBD治疗肝癌的相关靶点、通路和可能作用机制,并在肝癌细胞上进行验证,为临床应用提供更多的理论基础.1材料与仪器1.1细胞人肝癌细胞HepG2由四川大学生物治疗国家重点实验室全爱平老师馈赠.1.2实验药物将96 g中药复方浸泡于1L水中,武火烧开后文火煎煮30 min,滤出头煎,再加人1L水,文火煮30min后再次过滤.合并两次滤液,置于旋蒸仪中60、6 0 r/mi n 减压浓缩至2 g/mL(即每毫升水煎剂中含有2 g生药),使用0.2 2 m微孔滤膜过滤即得SBD中药原液,4保存.本课题组前期通过UPLC-ESI-HRMS技术共鉴定出SBD
13、种40 种化合物 3,质谱鉴定图详见图1.1.3试剂RIPA裂解液(购自北京索莱宝科技有限公司);BCA蛋白定量检测试剂盒(购自武汉亚科因生物技术有限公司);SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、-actin(购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司);TRIS、甘氨酸、SDS预制胶(购自美国赛默飞世尔科技公司);一抗(AKT1、M A PK 3)、二抗(购自武汉赛维尔生物科技有限公司)。A3740Ph1T05101520253035404550t/min14B132331012辣花酸311811302181517252720233513291622木犀草素山奈酚24榭皮素283951015202530
14、35404550t/min图1SBD中负离子模式(A)和正离子模式(B)下的基峰离子流图 3Fig.1Base peak ion(BPI)in negative ion(A)and positive ion(B)modes of SBD31.4仪器电泳仪、电泳槽、转印槽(购自美国赛默飞世尔科技公司);脱色摇床(购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。2方法2.1SBD活性成分的收集与筛选利用TCMSP(https:/ 个成分作为补充.依据口服生物利用度(o-ral bioavailability,OB)30%和类药性(drug-likeness,DL)0.18的原则筛选出数据库和质谱鉴定所包含的
15、所有药物活性成分,并通过检索文献,将虽未出现于数据库或OB、D L值不满足上述标准,但具有研究159三草保肝汤抗肝癌作用机制寸接技术探讨第2 期证实与肝癌相关的化学成分也统计为重要活性化合物,并在PubChem数据库中下载筛选出的活性成分的SMILES序列.2.2潜在作用靶点预测利用Swiss Target Prediction(h t t p:/w w w.s w i s-stargetprediction.ch/)数据库和TCMSP数据库进行靶点预测,合并二者交集,利用Uniprot(h t t p:/w w w.Unitprot.org/)数据库将预测得到的靶点名转化为相关基因名并作为药
16、物靶点.在 Genecard(h t t p s:/w w w.g e n e c a r d s.o r g/)数据库中通过检索关键词“liver cancer”“hepatocellularcarcinoma”“intrahepatic cholangiocarcinoma“PLK1“FGF-2”等,获得HCC相关疾病靶点.利用R语言将药物靶点与HCC疾病靶点进行映射,绘制SBD活性成分靶点和HCC疾病靶点的韦恩图,对应得到SBD对HCC的相关靶点.2.3网络构建使用Cytoscape软件构建“SBD-有效成分-潜在靶点 网络 6 ,将预选的潜在靶点导人STRING(h t t p:/s
17、t r i n g-db.org)数据库,选取置信度高于0.9的数据获得PPI聚类分析,将分析结果导入Cytoscape,借助CytoNCA插件中的Eigenvector(EC)、D e g r e e(D C)、Cl o s e n e s s(CC)、Be t w e e n n e s s(BC)、LA C(Lo c a l a v e r a g e c o n n e c-tivity-based method)、Ne t w o r k(NC)等参数筛选节点(n o d e),关键靶点的各参数值需大于平均值.筛选出的关键靶点导人Cytoscape绘制关键靶点PPI网络图.将关键靶点
18、与对应的化合物联系起来,导人Cyto-scape作图,得到“关键靶点-活性成分”网络图.在此类网络图中,节点(node)表示活性成分或者作用靶点,边(edge)表示活性成分与靶点之间的相互关系,与节点直接相连的其他节点的数目称为该节点的度值(degree)节点的度值越大,说明该节点所代表的活性成分或者靶点在交集网络中越重要,根据degree值筛选,获取SBD治疗肝癌的主要活性成分.2.4GO和KEGG富集分析将潜在作用靶点导人Matescape(h t t p s:/m e t a s-cape.org/)数据库,最小重叠度(minoverlap)=10,P临界值(Pcutoff)=0.0 1
19、,最小富集度(min enrich-ment)=1.5作为筛选条件,靶点与参数导入GO与KECG通路富集分析.使用在线作图平台微生信(ht-tp:/w w w.b i o i n f o r m a t i c s.c o m.c n/)对富集分析结果进行作图分析.2.5分子对接从RCSB-PDB(htp:/wwW.pdb.org)数据库 7 中检索靶点蛋白的晶体结构 8 ,对其进行去水、去配体、加氢以及电荷计算等预处理.将处理过的核心靶点蛋白晶体结构作为受体,从Pubchem数据库中查找活性成分,将活性成分的3D结构导入AutoDock进行分子对接分析,对接运算采用拉马克遗传算法,计算结合能
20、.最后利用PyMOL软件对分子对接结果进行可视化。2.6细胞实验在含有10%FPS的DMEM高糖培养基中培养HepC2细胞,培养基中添加10 0 g/mL的青霉素与100g/mL的链霉素.等待细胞贴壁后,每两天进行一次传代.HepC2以310/孔的数量铺于六孔板中.等细胞贴壁后,使用PBS清洗细胞2 次,除去含有血清和双抗的培养基,加入每毫升约含1mg生药的DMEM高糖培养基,与HepG2细胞共同作用2 4h.2.7蛋白免疫印迹法(Westernblot)收集HepG2细胞总蛋白,蛋白样品和SDS-PACE蛋白上样缓冲液4:1混合,取适量样品上样电泳,转膜后使用5%的脱脂牛奶封闭1h,一抗(1
21、:10 0 0)4封闭过夜.使用二抗孵育2 h,PBS清洗3次后使用增强型化学发光剂试剂(ECL)显影检测.2.8统计学处理使用prism8.0软件对所得数据进行统计学分析.采用单因素方差分析,P0.05为差异具有显著性.3结果3.1SBD活性成分筛选通过TCMSP数据库查询得到SBD共含有52 2 种成分,合并质谱鉴定出的40 种成分,共543种成分.依据OB和DL条件筛选出的有效成分,集合文献中出现的有效成分共得出50 个活性成分.利用TCMSP数据库和SwissTargetPrediction数据库对活性成分相关靶点进行预测,在50 个活性成分中,有14个成分未能匹配到对应靶点,剔除无对
22、应靶点成分后,获得36个活性成分,见表1.160第50 卷西南民族大自然科学版)表1SBD的有效成分Table 1Active ingredients of Bawei Baogan decoction编号成分CASOB(%)DLM0L000471芦荟大黄素481-72-183.380.24MOL005190迷迭香酸20283-92-571.790.24MOL002341橙皮素520-33-270.310.27MOL003648高丽槐素1990848-665.830.54MOL004328柚皮素480-41-159.290.21M0L006767Vulgaxanthin-I904-62-156
23、.140.26MOL000354异鼠李素480-19-349.60.31MOL000073(+)-表儿茶素35323-91-248.960.24M0L0040046-羟基木犀草素18003-33-346.930.28MOL000098皮素117-39-546.430.28MOL000449植物甾醇83-48-743.830.76MOL006772豆甾醇葡萄糖武19716-26-843.830.76MOL001749ZINC03860434117-81-743.590.35M0L001002花酸476-66-443.060.43MOL004355绿原酸327-97-942.980.76MOL01
24、2432杜鹃素24211-30-142.650.26M0L001494亚油酸乙酯544-35-442.000.19M0L000422山奈酚520-18-341.880.24MOL004798delphinidin13270-61-640.630.28MOL003851Isoramanone4644-99-939.970.51MOL007796stigmasteryl palmitate38.090.4MOL006756Schottenol521-03-937.420.75MOL006774stigmast-7-enol481-19-637.420.75MOL013359stigmasta-7-
25、en-3-ol37.420.75MOL005573芜花素437-64-937.130.24MOL000358beta-谷醇83-46-536.910.75MOL000359豆笛醇68555-08-836.910.75MOL005869西托糖苷474-58-836.910.75MOL000006木犀草素491-70-336.160.25MOL004350Ruvoside_qt6859-20-736.120.76MOL003044金圣草(黄)素491-71-435.850.27MOL001689金合欢素480-44-434.970.24MOL002714黄芩素491-67-833.520.21MO
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