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拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用.pdf
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1、拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用马疏言1,郑月萍1,2,郑志富1,2(1.浙江农林大学现代农学院,浙江杭州311300;2.浙江农林大学油料作物种质创新与利用研究所,浙江杭州311300)摘要:【目的目的】磷脂酸(PA)是甘油脂生物合成的前体,又是参与植物生长发育调节和各种逆境响应的重要信使物质,然而目前对植物细胞中 PA 含量动态变化的了解十分有限。本研究试图构建一种能有效监测植物细胞 PA 含量变化的荧光探针,并用之测定盐碱胁迫过程中胞内 PA 含量的变化。【方法方法】将 Spo20p 蛋白中高度专一的 PA 结合域相对应的核苷酸序列与绿色荧光蛋白基因融合,经遗传转化获得携带该融合基因的转
2、基因拟南芥 Arabidopsis thaliana 株系,其表达受组成型启动子 UBQ10 驱动,产生的融合蛋白成为专一结合 PA 的荧光探针。随后,运用该荧光探针监测盐碱胁迫下胞内PA 含量的变化。【结果结果】构建获得 7 个不同的纯合、单插入位点转基因拟南芥株系。实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)分析显示:不同株系中融合基因的表达量存在差异。不同浓度外源 PA 处理试验显示:随着表达量的升高,PA 探针可有效监测到 2molL1PA 处理根尖 10min 后细胞中 PA 含量的变化;而当 PA 探针表达量较低时,对 PA 监测灵敏度显著下降,表明在一定程度上荧光探针对 PA 监测的灵
3、敏度与其表达量相关联。运用 PA 荧光探针发现:盐碱胁迫处理根尖 5min 即可诱导质膜上或胞内 PA 的积累,暗示 PA 在植物早期盐碱胁迫响应中可能产生重要作用。【结论结论】本研究构建了一种可对细胞内 PA 含量进行有效监测的荧光探针,该探针可用于监测植物盐碱胁迫早期响应过程中胞内 PA 水平的变化,从而为早期逆境响应研究提供新工具。图 7 表 1 参 36关键词:磷脂酸;荧光探针;转基因;盐碱胁迫;拟南芥中图分类号:Q946.5文献标志码:A文章编号:2095-0756(2024)01-0104-09Generationandapplicationofafluorescentprobef
4、orphosphatidicacidinArabidopsis thalianaMAShuyan1,ZHENGYueping1,2,ZHENGZhifu1,2(1.College of Advanced Agricultural Sciences,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,Zhejiang,China;2.Institute for Oilseed Crop Germplasm Innovation and Utilization,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,Zhejiang,China)
5、Abstract:Objective Phosphatidic acid(PA)serves as an important signal molecule involved in theregulationofplantgrowthanddevelopmentanddifferentresponsestovariousstressesaswellasageneralprecursorforglycerolipidbiosynthesis.However,littleisknownthusfaraboutthedynamicchangesofPAinplantcells.Thisstudyat
6、temptedtoconstructafluorescentprobethatcaneffectivelymonitorthechangesofPAinplantcellsanduseittomeasurethechangesofintracellularPAundersaline-alkalinestresses.MethodThecorrespondingnucleotidesequenceforPA-specificbindingdomainwithintheSpo20pproteinwasfusedtothegreenfluorescentproteingene.TransgenicA
7、rabidopsis thalianalinesbearingthefusiongeneunderthecontrol收稿日期:2023-06-08;修回日期:2023-07-27基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(32100209);浙江省自然科学基金青年基金资助项目(Q21C020003);国家自然科学基金面上基金资助项目(31871660)作者简介:马疏言(ORCID:0009-0007-5802-6691),从事植物生理生化与代谢调控研究。E-mail:。通信作者:郑志富(ORCID:0000-0002-8247-5629),教授,从事植物生化和代谢研究。E-mail:浙江农林
8、大学学报,2024,41(1):104112Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20230355oftheconstitutivepromoterUBQ10wasthengeneratedviagenetictransformation.TheresultingfusionproteinconstitutedafluorescentprobespecificallybindingtoPA.Subsequently,thisprobewasemployedtomonitorthe changes of c
9、ellular PA under saline-alkaline stresses.Result Seven transgenic A.thaliana lineshomozygousforsingleinsertionofthefusiongenewasgenerated.RealtimequantitativePCR(RT-qPCR)analysis showed that expression levels of the fusion gene varied among different lines.Experiments withvariousexogeneousPAconcentr
10、ationsrevealedthatastheexpressionlevelofthePAprobeincreased,itcouldeffectivelymonitorthechangesofcellularPAintheroottipstreatedwith2molL1exogenousPAfor10min,whereas this was not the case when the expression level of the probe was low,indicating that thesensitivityoftheprobeforPAdetectionis,toacertai
11、ndegree,associatedwithitsexpressionlevel.BasedonthisfluorescentPAprobe,PAaccumulationattheplasmamembraneorintheintracellularspacewasevidentintheroottipsundersaline-alkalinestressesfor5min,implyingthatPAmayplayimportantrolesinearlyplantresponsestosaline-alkalinestresses.ConclusionAfluorescenceprobefo
12、reffectivemonitoringofcellularPAwasdevelopedinthisstudy.ThisprobecanmonitorthealterationsincellularPAlevelduringearlyplantresponsestosaline-alkalinestresses,therebyprovidinganewtooltostudyearlyresponsestovariousstresses.Ch,7fig.1tab.36ref.Key words:phosphatidicacid;fluorescentprobe;transgene;saline-
13、alkalinestress;Arabidopsis thaliana磷脂酸(phosphatidicacid,PA)是一种常见的细胞甘油磷脂,也是最简单的膜脂之一1。几乎所有生物体内都会产生 PA,包括酵母2、动物3和植物4等。在植物中 PA 的合成主要包括 2 种方式:第 1 种是从头合成途径,3-磷酸甘油先后在 3-磷酸甘油酰基转移酶和溶血磷脂酸脂酰基转移酶的作用下发生连续 2 步酰化反应生成 PA,这也是 PA 合成的主要途径5;第 2 种是磷脂的降解途径,磷脂降解又可分为2 种,一种是磷脂酶 D 通过水解某些结构磷脂直接生成 PA69,另一种是磷脂酶 C 通过水解磷脂酰肌醇生成二脂酰
14、甘油10,继而经二脂酰甘油激酶磷酸化生成 PA11。PA 作为一种结构膜脂,磷酸基团头部能够以“静电/氢键开关模型”的方式与蛋白质结合12。在该模型中,PA 结合蛋白中带正电荷的碱性氨基酸残基1317,可以吸引磷脂双分子层上的负电荷,并通过静电作用影响膜环境,继而与 PA 头部的磷酸基团形成氢键,产生一个稳定的蛋白质结合位点。PA 这种携带负电荷并且在生理条件下呈圆锥体的独特分子构型18,使得 PA 结合蛋白的结构域能够特异性的与其结合,保证了生物膜结构的稳定和功能的发挥。除了作为膜脂的一个结构成分以及甘油脂合成的前体物质,PA 还是一个关键信号分子,在多种生物学过程中发挥重要作用。正常条件下
15、,行使信号功能的 PA 含量甚微;在植物应答各种生物与非生物胁迫过程中 PA 水平则会迅速升高,但这种积累往往是短暂的。这说明生物体拥有一套严格控制信号分子 PA 含量的机制,这对调节 PA 信号传递强度、维持细胞物质与能量代谢的动态平衡至关重要1922。尽管 PA 拥有多种功能,但目前对于细胞内 PA 含量的动态变化仍知之甚少,这主要受 PA 检测手段的限制。过去主要采用诸如薄层层析、高效液相色谱和放射性同位素标记等理化手段对其含量进行测定23。近年来,质谱分析技术的应用使得对包括 PA 在内的各种脂质的测定更准确和高效2425。然而,这些理化手段都只能对组织器官中 PA 总量与种类进行定量
16、或定性分析,无法捕捉细胞内 PA 的动态与瞬时变化信息。通常认为,内质网上的 PA 含量相对较高,这有助于促进磷脂和三酰甘油的合成2627;而质膜和细胞器中行使信号功能的 PA 含量甚微。显然,采用理化测定会掩盖胞内 PA 的真实变化。因此,亟需开发一种能可视化分析细胞内 PA 的工具。大量研究表明:生物体中 PA 结合蛋白种类繁多,这些蛋白中的 PA 结合域(phosphatidicacidbindingdomains,PABD)结构亦存在差异。其中一些 PABD 因与 PA 结合专一性强,被用来开发多种 PA 探针2833。酵母蛋白 Spo20p 中的 PA 结合域已被证实具有极强的专一性
17、33,只结合 PA 而不结合其他磷脂。目前基于这一 PABD 所开发的 PA 探针在医学研究中应用广泛,但在植物中的应用却有限34。因此,本研究旨在构建基于 Spo20p 中的 PABD 的植物 PA 荧光探针,为剖析植物早期应答逆境胁迫的细胞分子机制提供新工具。第 41 卷第 1 期马疏言等:拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用1051材料与方法1.1植株培养1.1.1土壤基质的培养将拟南芥 Arabidopsis thaliana 种子置于含有湿润滤纸的培养皿中,4 冰箱内避光放置 3d 后将其点播在湿润的土壤基质上(V营养土V蛭石V珍珠岩=311)。将播种后的盆栽用透明塑料盖覆盖,置于242
18、5 室温、50%60%湿度、14h 光照/10h 黑暗的植物培养箱中培养,7d 后揭去塑料盖间苗。1.1.2培养基的培养将拟南芥种子进行消毒,加入适量灭菌过的蒸馏水,在 4 冰箱内避光放置 3d,点播在 1/2MS 培养基上,置于植物培养间中培养。1.2PA 荧光探针的构建1.2.1pSY06-GFP-PABD 载体的构建酵母蛋白 Spo20p 中存在一个高度专一的 PA 结构域(PABD),该PABD 由 40 个氨基酸残基构成,只结合 PA 而不结合其他磷脂3334,因此,本研究选择该 PABD 与荧光蛋白融合,构建 PA 荧光探针。根据 PAPD 核苷酸序列33设计引物(表 1)进行 P
19、CR 扩增,获得与该PABD 相对应的 DNA 片段;同时 PCR 扩增获得 GFP 基因编码区序列。随后,利用无缝克隆试剂盒(生工),将 GFP 和 PABD 片段克隆至植物表达载体 pSY06 的限制性内切酶位点 KpnI 和 PstI 之间,获得重组质粒 pSY06-GFP-PABD。PABD 连接至 GFP 基因编码区的 3端,构成 GFP-PABD 融合基因,该融合基因的表达由组成型启动子 UBQ10 驱动。重组质粒中的插入片段经菌落 PCR、KpnI 和 PstI 双酶切以及测序验证正确后,采用热激法将质粒转化至农杆菌 Agrobacterium tumefaciensGV3101
20、,用于后续拟南芥遗传转化。表1相关引物序列Table1Sequenceofrelatedprimers用途引物名称引物序列(53)PABD基因合成ZYP301CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCTZYP302GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAAZYP303TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATT
21、TCAAGGCTAAZYP304GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCCZYP305CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTCPABD基因克隆ZYP308TCCGGACTCAGATCTCGAGCZYP309AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTCGFP基因克隆ZYP306TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGAZYP307AGATCTGAG
22、TCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC转基因拟南芥鉴定MSY01TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCGMSY02TCATCATGACAGATCTGCGC表达量分析ZYP389GACCACTACCAGCAGAACACCZYP390CTTGTACAGCTCGTCCATGC1.2.2拟南芥的遗传转化、筛选及鉴定以哥伦比亚野生型拟南芥(WT)为植物材料,利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥。将获得的 T1代拟南芥种子进行表面消毒,均匀铺在含有草铵膦(10mgL1)和特美汀(50mgL1)的 1/2MS 筛选培养基上进行筛选。将具有除草剂抗性的阳性苗移
23、栽到土壤中继续培养,3 周后提取叶片 DNA 并设计引物(表 1)进行 PCR 鉴定,对 T2和 T3代转基因株系进行除草剂抗性的遗传分析,最终筛选得到纯合单插入位点转基因株系。1.3转基因拟南芥中目的基因表达量分析以在 1/2MS 培养基中生长 7d 的转基因拟南芥根系作为测定材料,使用高纯度 RNA 提取试剂盒(全106浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日式金)提取 RNA 并对其进行纯度检测和浓度测定。取等量 RNA,使用反转录试剂盒(翌圣)进行单链cDNA 的合成。选择拟南芥肌动蛋白基因 Actin 为内参基因,设计引物(表 1)进行实时荧光定量 PCR(RT-qPCR),并
24、对数据采用 2Ct法进行分析。1.4PA 荧光探针转基因拟南芥的表型观察将野生型和转基因株系种子点播在 1/2MS 方形培养基上,竖直培养 6d 后,挑选长势均匀一致的幼苗(每个基因型,20 株),分别转移至含有 0 和 50mmolL1NaCl 的 1/2MS 固体培养基中继续竖直培养,7d 后观察表型。1.5PA 荧光探针灵敏度分析将在 1/2MS 方形培养基上竖直培养 6d 的幼苗分别浸泡在含有 0、2 和 10molL1PA 的 1/2MS 液体培养基中,依次处理 5、10、15 和 20min 后,利用荧光显微镜(ZEISS,AxioImager2)对拟南芥根尖分生区 PA 的分布进
25、行观察并拍照。1.6盐碱胁迫下根尖 PA 的检测将含 PA 荧光探针的拟南芥转基因株系种子点播在 1/2MS 方形培养基上,竖直培养 6d,选择均匀一致的幼苗分别浸泡在含有 100mmolL1NaCl、10mmolL1NaHCO3和兼含两者的 1/2MS 液体培养基中,处理 5、10 和 15min 后用荧光显微镜观察根尖分生区 PA 的分布。2结果与分析2.1PA 荧光探针的设计及其转基因拟南芥的获得如图 1 所示:该载体以 pSY06 为骨架,由 35S启动子驱动植物选择标记基因草铵膦抗性基因(bar)的表达,而 GFP-PABD 融合基因的表达则由 UBQ10 启动子驱动。barGFP3
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