绿原酸对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫寿命及抗氧化活性的调控.pdf

40(1)108-116 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 2 月 收稿日期：2022-12-09 基金项目：国家自然科学基金（31960559）；甘肃省科技计划（21JR7RA819）；甘肃农业大学大学生创新创业科研训练计划（202213021）作者简介：陈红，硕士研究生，E-mail：；*通信作者，博士，副教授，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.01.040 绿原酸对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫寿命及 抗氧化活性的调控 陈 红，李茜童，王兴铎，钱秀娟*（甘肃农业大学植物保护学院，兰州 730070）摘要：为观察绿原酸（CGA）对昆虫病原线虫寿命及抗氧化活性的影响，探究绿原酸对线虫生命活动的调控机制，本文以卡森斯氏线虫作为抗衰老模型，用不同浓度的绿原酸（0、50、100、500、1000 mol/L）处理，探究其对卡森斯氏线虫寿命、抗氧化活性、脂褐素水平、相关基因 mRNA 表达水平的调控作用，初步探讨绿原酸的潜在作用机理。结果表明，与空白对照组相比，用 100 mol/L 绿原酸刺激线虫后使处理组最长寿命增加了 36.36%，显著抑制体内脂褐素的积累；且该浓度刺激线虫体内的 SOD 和 CAT 酶活力，分别提高了 1.97 倍和 2.47 倍；此外，qRT-PCR 结果显示，100 mol/L CGA 喂养线虫后，daf-16、gst-4 基因转录水平相比对照分别提高了 1.78、3.51，而 daf-2 基因转录水平呈下降的趋势，降低了 0.13。综上可知，绿原酸通过胰岛素/IGF-1信号通路提高昆虫病原线虫卡森斯氏线虫机体的抗氧化能力并延长昆虫病原线虫的寿命。关 键 词：绿原酸；昆虫病原线虫；寿命；抗氧化；胰岛素/IGF-1 信号通路 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2024)01-0108-09 Regulation of Longevity and Antioxidant Activity in Entomopathogenic Nematodes Steinernema kraussei by Chlorogenic Acid CHEN Hong,LI Xitong,WANG Xingduo,QIAN Xiujuan*(College of Plant Protection,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)Abstract:The effects of chlorogenic acid(CGA)on the longevity and antioxidant activity of the entomopathogenic nematodes(EPNs)Steinernema kraussei were investigated through treating S.kraussei with different concentrations of chlorogenic acid(0,50,100,500,1000 mol/L)and then recording S.kraussei longevity,antioxidant activity,lipofuscin levels,and related genes mRNA expression levels,with the aim to explore the potential mechanisms of action of chlorogenic acid.The results showed that the maximum longevity of S.kraussei was increased by 36.36%in the treatment with100 mol/L chlorogenic acid in comparison to the control,significantly inhibited the accumulation of lipofuscin related to aging,but increased SOD and CAT enzyme activities by 1.97 and 2.47 times,respectively.Moreover,qRT-PCR results showed that daf-16 and gst-4 genes transcription levels was increased by 1.78 and 3.51,respectively,in the nematodes fed with 100 mol/L CGA compared with the control.However,the daf-2 gene transcription level showed a downward trend and decreased by 0.13.This study demonstrates that chlorogenic acid enhances the antioxidant activity and prolong the longevity of entomopathogenic nematodes S.kraussei by regulating the insulin/IGF-1 signaling pathway.Key words:chlorogenic acid;entomopathogenic nematodes;lifespan;antioxidant;insulin/IGF-1 signaling pathway 第 1 期 陈红等：绿原酸对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫寿命及抗氧化活性的调控 109 绿原酸（Chlorogenic acids，CGA）是一种可以在许多植物中发现的天然多酚类化合物1。CGA 作为一种抗氧化剂，具有较广泛的抗菌作用及很强的抗氧化能力2。生物体在代谢过程中不断产生自由基，可破坏生物膜，形成脂褐素在机体内积累，导致抗氧化系统失衡，进而引起衰老。已有研究表明 CGA 在许多疾病模型中有效，改善伴随人们衰老而发生的疾病，如抗氧化作用和对抗糖尿病和心血管疾病3。此外，越来越多的证据表明，CGA 在刺激胰岛素分泌、改善糖耐量和胰岛素抵抗方面具有较强的生物活性4，迄今为止，这些效应的机制尚不明确。虽然衰老是不可避免的，但衰老的过程在很大程度上是可以被调节和调控的。因此，当体内抗氧化酶难以抵挡自由基的过度富集，需要补充天然无毒的抗氧化剂来缓解细胞损伤及许多流行病5。有研究发现，从酵母、蠕虫到哺乳动物，如小鼠、猕猴和人类6，衰老信号通路都是保守的，且绿原酸可通过胰岛素信号通路延长线虫的寿命。衰老的特征是组织和功能的退行性变化，由于秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans 寿命短和对基因操纵的适应性，是识别遗传因素或筛选具有长寿调节效应的化学物质的优秀模型7，因此可以测量与年龄相关的行为变化，如咽部泵送率和生物化学物质，脂褐素积累8。对一系列线虫突变体的遗传分析表明，CGA 通过胰岛素/IGF-1 信号通路（Insulin-like growth factors，胰岛素样生长因子）延长了线虫的寿命。Kenyon 等9在调查线虫 dauer 停滞期的基因时发现了胰岛素/胰岛素样生长因子 1 信号（insulin/insulin-like growth factor-1 signaling，IIS）通路，通过相关基因组件之间相互联系，最终对线虫起调控作用。胰岛素信号通路是一条由多基因编码的信号通路，如在 Dorman 等10的研究中证实，IIS 通路的相关组件 daf-16 和 daf-18 参与 age-1 突变株的长寿表型的表达。而在 Blackwell 等11的研究中同样发现，SKN-1 可调节线虫蛋白质稳态及代谢等功能，在线虫药物性和遗传性延寿中起着关键作用，因此证明了 SKN-1 在调节寿命中起重要作用，而谷胱甘肽 s-转移酶（gst-4），是由 IIS 依赖的转录因子DAF-16 和 SKN-1 调控的。有报道称绿原酸通过与年龄相关氧化应激反应的衰减而延长秀丽隐杆线虫的寿命12。因此，除了线虫自身的调控外，当人为的对胰岛素通路施加外源性药剂后，也可以干预线虫的寿命长短。综上所述，研究 IIS 通路调控线虫寿命的机理，不仅为延长线虫制剂货架期和提高生物防治效果提供理论依据，而且将来对人类寿命的延长也有着重要意义。昆虫病原线虫（Entomopathogenic Nematodes，EPN）是指体内携带致病性的共生细菌，能使寄主发病并死亡的一类线虫，它具有成本低，繁殖能力强，对人畜及环境安全，有巨大的开发潜力和市场应用前景13-15。目前，以秀丽隐杆线虫作为模式生物，通过激活 IIS 通路测定其体内的抗氧化酶活力、寿命、相关基因的表达水平的研究较多16,17。基于秀丽隐杆线虫与昆虫病原线虫的遗传物质高度同源性，且昆虫病原线虫作为一种有效的生防因子，其寿命及货架期的长短直接制约着该商品制剂的开发速度，然而在利用胰岛素信号通路及外源干扰延长其寿命和增强抗氧化应激能力方面的研究目前还未见报道。因此，探究胰岛素信号通路在昆虫病原线虫是否和秀丽隐杆线虫具有同样的调控作用，亟待研究。综上所述，本研究以昆虫病原线虫卡森斯氏线虫为模型，研究了绿原酸对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫寿命延长和抗氧化性的潜在影响。此外，我们还进一步探讨了胰岛素/IGF-1 通路中长寿调控的关键基因 daf-16、daf-2 以及抗氧化性基因 gst-4是否参与了其内在机制。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 供试线虫及昆虫 昆虫病原线虫卡森斯氏线虫 Steinernema krussei 0657L 品系18由甘肃农业大学生物防治工程实验室保存并提供。供试寄主昆虫大蜡螟 Galleria mellonella 末龄幼虫购自天津玉米虫养殖场，已滞育处理，防止大蜡螟老熟幼虫吐丝、化蛹。1.1.2 仪器和试剂 主要仪器：恒温培养箱（上海博讯实业有限公司，BSP-100）、控温冰箱（青岛海尔股份有限公司，BCD-226STV）、超净工作台（青岛海尔股份有限公司，HCB-1300V）、人工气候室（杭州琦胜电子科技有限公司，QRGN-800-3）、电子天平（ER-180，AND）、冷光源解剖镜（甘肃嘉瑞贸易有限责任公司，SZX16EP50）、制冰机（太仓市华利达实验设备有限公司）、自动纯水系统（北京普析通用仪器有限公司）、酶标仪（BioTek Instruments，Inc）、96 孔板（Corning Incorporated）、PCR 仪（美国 110 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 Bio-Rad 公司）、恒温培养摇床（上海跃进医疗器械有限公司，HZP-91）。主要试剂：绿原酸（分子式 C16H18O9，分子质量 354.31）购自上海生工；牛肉汤蛋白胨、溴百里酚蓝、琼脂粉、胰蛋白胨大豆肉汤、酵母提取物、六水氯化镁、氯化钠、氯化钾、氯化钙均采购自上海生工；Trizol试剂（上海生工），cDNA 反转录试剂盒（宝生物工程有限公司）、SOD 试剂盒、CAT 试剂盒均采购自上海优选。1.1.3 培养基 LB 培养基：牛肉汤蛋白胨 8 g/L、琼脂粉 15 g/L、酵母提取物 5 g/L、六水氯化镁 2 g/L、玉米糖浆 7 mL/L、玉米油 4 mL/L（1 L 培养基的配制）；TSY 培养基（共生细菌液体培养基）：胰蛋白胨大豆肉汤 40 g/L、酵母提取物 5 g/L（1 L 培养基的配制）。PBS 缓冲液：购买自上海生工。1.2 单菌线虫的制备 在直径为 9 cm 的培养皿内垫两层无菌滤纸，每皿 5 头放入经 75%酒精消毒的 3 龄大蜡螟幼虫，移液枪吸取 1.5 mL 密度为 3.84 头/L 的卡森斯氏线虫 0657L 线虫悬浮液。侵染 7 d 后，在显微镜下解剖侵染至死的大蜡螟虫尸，观察并分别挑取体内的怀卵大母虫 1 头，接到长好共生细菌的 LB 平板培养基上，重复30 次，用封口膜密封培养基，并将培养基置于培养箱中继续培养，每 24 h 观察一次幼虫发育情况，连续观察 2 周。1.3 线虫同期化培养 同期化处理的线虫采用离体培养，具体方法如下：在体视显微镜下，用自制挑针选取腹内怀卵的大母虫，接至长好共生细菌的 LB 平板培养基。培养 68 h 后，将完成产卵的成虫从 LB 培养基中挑出，待卵孵化后，即可作为同期化线虫用于后续试验。1.4 寿命测定 线虫同期化后，随机分为 5 组，分别培养在接至长好共生细菌的 LB 培养基上，将同期化的线虫，随机挑取 30 条 J4（第一次出现时期：15 d）至加药组（50、100、500、1000 mol/L CGA），以空白为对照（Control），此时记为第 0 d，25 下培养，每天同一时间将线虫转移至新的同浓度培养皿内，同时挑出死亡线虫，记录存活个数，计算存活率，直至所有线虫死亡。钻入培养基的线虫及因其他因素死亡的线虫不计入数据，重复试验 3 次，绘制寿命曲线。1.5 不同浓度绿原酸对卡森斯氏线虫 0657L 体内脂褐素的影响测定 脂褐素是一种自发荧光色素，作为线虫氧化应激的指示剂，其含量随线虫年龄的增加而逐渐增加，最终加速线虫的衰老19。将同期化的卡森斯氏线虫 0657L 随机挑取 30 条转移到直径为 9 cm 的培养皿中，每皿添加 200 L 不同浓度（50、100、500、1000 mol/L）的 CGA，以空白为对照组，预先培养 5 d 后，将线虫移至滴有 1%琼脂糖的载玻片上，并用 NaN（320 mol/L）麻醉。在荧光显微镜下，激发波长 340380 nm，发射波长 430 nm 下观察不同浓度 CGA 组线虫体内的脂褐素荧光强度，拍摄荧光图片，并以 Image J软件计算线虫体内荧光密度，绘制柱状图。1.6 抗氧化酶活力测定 抗氧化酶活性及含量直接影响线虫机体在氧化损伤中的免疫能力20。收集同期化线虫（J4），培养方法同寿命试验，2 d 后，PBS 缓冲液冲洗线虫至 EP 管，PBS 洗涤并加入 200 L PBS 缓冲液于超声破碎仪上破碎，取上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒的操作步骤测定 SOD、CAT 活力。重复试验 3 次。1.7 衰老相关基因测定 线虫同期化后收集虫卵孵化 J4线虫，将同期化线虫分别在空白或含有 100 mol/L CGA 接有共生细菌的 LB 培养基中培养 48 h 后，收集线虫，PBS 缓冲液冲洗线虫至 EP 管，每管含线虫约 2000 条，PBS 洗涤3 次。含线虫悬液的 EP 管放入80 冰箱备用。液氮条件下进行线虫体内 RNA 的提取、cDNA 的合成，并进行实时荧光定量 PCR 测定，以 act-1（actin）为内参测定 daf-16 及其下游靶基因的表达量，基因表达以 PCR 的 2Ct值计算 100 mol/L CGA 处理组较之对照组 daf-2、daf-16、gst-4 基因转录水平的差异，引物序列见表 1。第 1 期 陈红等：绿原酸对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫寿命及抗氧化活性的调控 111 表 1 线虫抗衰老相关基因实时定量 PCR 引物 Table 1 Real-time quantitative PCR primers for entomopathogenic nematodes aging-related genes 基因 Genes 正向引物 Forward primer 5-3 反向引物 Reverse primer 5-3 act-1 CTCTTGCCCCATCAACCATGA TTTGTGCAAGTTGACGAAGTTGT daf-2 TGGATCTCCATCGCGAAACG TTTTGGGGGTTTCAGACAAGT daf-16 TTACATTGCTCGAAGTGCCG GGCGAATCGAGCTCACGAC gst-4 CTCTTGCTGAGCCAATCCGT TGGCCAAATGGAGTCGTTGG 1.8 数据统计与分析 使用 SPSS 26 软件进行统计分析，计量资料用平均数标准差表示。通过单因素方差分析（oneway ANOVA）和最小显著差异 t 检验（least significant difference test）对观察到的差异进行统计学检验，P0.05（双侧）为差异具有统计学意义。所有试验均独立重复 3 次。2 结果与分析 2.1 CGA 对卡森斯氏线虫 0657L 寿命的影响 自然寿命是进行寿命研究分析的首选指标。为了确定 CGA 对卡森斯氏线虫 0657L 寿命的调控作用，用 01000 mol/L 的 CGA 浓度处理线虫。经单因素方差分析，5 组不同浓度处理下寿命无统计学差异（F4,100.868，P0.504）。采用 LSD-t 检验分别与对照组相比，给予绿原酸（50 mol/L、100 mol/L、500 mol/L和 1000 mol/L）后线虫的平均寿命由 5.5（0.5）d 分别增加至 6.5（0.5）d、7.5（0.6）d、6.1（0.5）d、6.0（0.6）d，线虫的寿命分别延长了 18.18%、36.36%、10.9%、9.10%（P0.001、P0.001、P0.001 和 P0.001）（图 1，表 2）。从试验结果可以看出，绿原酸对卡森斯氏线虫 0657L 的寿命均有延长作用，且在 100 mol/L 浓度下，CGA 能显著延长卡森斯氏线虫 0657L 的寿命（P0.001），因此，在后续的基因表达试验中均采用 100 mol/L 浓度。存活率 Percent survial(%)图 1 绿原酸对卡森斯氏线虫 0657L 寿命的影响 Fig.1 Effect of CGA on lifespan of S.kraussei 0657L 2.2 CGA 对卡森斯氏线虫 0657L 脂褐素的影响 在线虫的同一时期，CGA 处理组的线虫体内自发的荧光强度较对照组均有不同程度的降低。经单因素方差分析，5 组不同浓度处理下的脂褐素积累差异具有统计学意义（F4,1025.434，P0.001）（图 2）。采用 LSD-t 检验分别与对照比较，50 mol/L、100 mol/L、500 mol/L 和 1000 mol/L 绿原酸组线虫的脂112 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 褐素含量比对照组分别降低了 33.74%、35.78%、11.80%、50.84%（P0.001，P0.001，P0.064，P0.001）。该结果表明，CGA 延缓了线虫与年龄相关的身体衰退的特征。表 2 不同质量浓度 CGA 对卡森斯氏线虫 0657L 平均寿命的影响 Table 2 Effects of different mass concentrations of CGA on the average lifespan of S.kraussei 0657L 组别 Groups 剂量 Dose(mol/L)平均寿命 Mean lifespan(d)寿命延长率 Life extension rate(%)Control 0 5.50.5 50 6.50.5 18.18%100 7.50.5*36.36%500 6.10.5 10.90%CGA 1000 6.00.6 9.10%注：*表示用 Long-Rank 检验进行 Kaplan-Meier 生存分析，与对照相比较 P0.001。Note:*means P0.001 compared with control by Kaplan-Meier survival analysis with Long-Rank test.ABCDE绿原酸质量浓度 CGA concentration(mol/L)荧光强度Relative lipofuscin fluorescence A：Control；B：50 mol/L CGA；C：100 mol/L CGA；D：500 mol/L CGA；E：1000 mol/L CGA 注：*代表与对照相比 P0.001.Note:*means P0.001 compared with control.图 2 绿原酸对卡森斯氏线虫 0657L 脂褐素沉积的影响 Fig.2 Effects of CGA on the lipofuscin accumulation of S.kraussei 0657L 2.3 CGA 对卡森斯氏线虫 0657L 抗氧化酶活力的影响 线虫体内 SOD 活性和 CAT 活性均与适宜的 CGA 浓度剂量有一定的关系，剂量太低或太高都会降低SOD 和 CAT 活性。经单因素方差分析，5 组不同浓度处理下的抗氧化酶 CAT 和 SOD 活力差异具有统计学意义（F4,1027.916，P0.001；F4,105.497，P0.013），其中 100 mol/L CGA 和 500 mol/L CGA浓度处理组 CAT 的活性较对照，分别提高了 1.97 倍和 1.37 倍（P0.05，P0.05）；同时在相应的浓度处理下，卡森斯氏线虫 0657L SOD 活性较对照，也分别增加了 2.47 和 1.63 倍（P0.05，P0.05）。以上数据表明绿原酸可在一定程度上提高卡森斯氏线虫 0657L 体内抗氧化能力，缓解氧化损伤及线虫衰老，具有激活线虫体内抗氧化防御系统的潜力（图 3）。第 1 期 陈红等：绿原酸对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫寿命及抗氧化活性的调控 113 Control501005001000*ns*nsnsnsControl501005001000600500400300200100020016012080400绿原酸质量浓度 CGA concentration(mol/L)绿原酸质量浓度 CGA concentration(mol/L)注：*代表与对照相比 P0.05.Note:*means P0.05 compared with control.图 3 绿原酸对卡森斯氏线虫 0657L 体内 SOD 和 CAT 活性的影响 Fig.3 Effect of CGA on SOD and CAT activity of S.kraussei 0657L 2.4 CGA 对卡森斯氏线虫 0657L 基因表达的影响 综合上述结果，绿原酸可延长线虫衰老，并且在 100 mol/L 时效果最佳，但是影响卡森斯氏线虫 0657L寿命的作用机制尚不清楚。因此，为了进一步检测 CGA 对卡森斯氏线虫 0657L 体内寿命及抗氧化分子机制，利用 PCR 技术对 Insulin/IGF-1 信号通路上关键因子进行分析。该通路主要起调节作用的信号基因有daf-2、daf-16 和 gst-421。首先，确定了与寿命相关的基因（daf-2、daf-16）表达水平。其次，确定了与抗氧化性相关的基因（gst-4）表达水平，结果表明，绿原酸可以影响 daf-2、daf-16、gst-4 的表达（图 4）。对照组的基因表达定义为 1。与对照组相比，在绿原酸处理后，线虫体内的 daf-16（长寿型）、gst-4（抗氧化型）的 mRNA 的相对表达量较空白组相比显著上调至 1.780.27、3.510.04（P0.05），而 daf-2（胰岛素受体样基因，在线虫内调控长寿）的 mRNA 的相对表达量较空白组相比下调至 0.130.22。以上结果表明，CGA 是通过下调 daf-2 基因、上调抗氧化 gst-4 基因的表达及寿命调控因子 daf-16 水平，提高卡森斯氏线虫 0657L 抵抗氧化应激及延缓衰老的能力。*ns100 mol/L CGAControl543210daf-2daf-16gst-4mRNA/act-1 注：*代表与对照相比 P0.05，ns 代表无差异。Note:*means P0.05 compared with control,ns indicated there is no significant difference between treatments.图 4 绿原酸对卡森斯氏线虫 0657L 衰老相关基因表达的影响 Fig.4 Effect of CGA on expression of senescence related genes in S.kraussei 0657L 114 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 3 讨论 CGA 是人类饮食中最丰富的多酚类化合物之一，具有多种有益的生物活性，如抗氧化性、调节酶活性、转录因子的激活和基因表达等22,23。所以，CGA 是否可以延缓生物体线虫的衰老过程？该研究结果表明，CGA 可以延长昆虫病原线虫的寿命，并且存在剂量效应，延缓与年龄相关的脂褐素积累，提高对氧化应激的抵抗力。本研究发现 CGA 显著延长了线虫的平均寿命，与对照组相比，100 mol/L CGA 处理可有效延长卡森斯氏线虫 0657L 的寿命约 7.5 d（图 1）。有些学者发现适宜剂量的毛竹多糖24、金钗石斛多糖25和甘草26均能显著延长秀丽隐杆线虫的平均寿命，该研究发现绿原酸在延长卡森斯氏线虫 0657L 寿命方面与以上 3 种物质效果相似。细胞发生氧化应激进而发展到细胞损伤等一系列级联反应，往往是由抗氧化酶类物质难以清除过量的自由基所致，ROS 的清除主要依赖于抗氧化酶，其中最重要的是超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）。线虫体内 SOD-3 是 DAF-16 的转录靶点之一，编码线粒体内清除自由基的超氧化物歧化酶 Mn-SOD27。在这一过程中，SOD 和 CAT 发挥了重要作用。CAT 和 SOD 活性水平间接反映了机体清除氧自由基的能力。本研究明确了经 CGA 处理后的线虫可以明显改善因衰老引起脂褐素的异常堆积，提高内源性抗氧化酶 SOD 和 CAT 的酶活力，说明绿原酸可以提高线虫的抗氧化能力，从而延长卡森斯氏线虫 0657L 的寿命，也与前人有关外源化合物通过影响抗氧化酶而影响生命体寿命的结果一致。胰岛素/IGF-1 信号传导（IIS）途径是调节秀丽隐杆线虫衰老的主要途径，该途径从 DAF-2 胰岛素受体通过 AGE-1/PI3K 到 AKT-1/2，再到 DAF-16/FOXO 转录因子，从而控制线虫的寿命和相关代谢28。研究表明，昆虫胰岛素信号通路主要通过调控昆虫的滞育以及抗逆性等过程来影响寿命29。从人类到线虫，这种寿命调控途径一直是高度保守的30,31，且胰岛素信号通路在人类中也可能发挥着调节寿命的作用，世界范围的几大长寿人群调查结果表明，胰岛素信号通路中的 AKT-1/AKT-2 和 DAF-16/FOXO 的变异与寿命延长密切相关32，为探究绿原酸延长卡森斯氏线虫 0657L 是否涉及此条通路，本文测定了通路中几个主要基因的表达。胰岛素信号通路是高度保守的衰老调控通路，该通路中 daf-16 受 daf-2 负调控若受到外界刺激时33，DAF-16 可诱导多种应激抵抗基因的表达，从而激活其下游氧化应激基因 gst-4（胰岛素信号通路下游靶点，参与氧化应激反应），进而介导应激抵抗，延长寿命34。已有研究表明，紫山药多糖通过胰岛素信号通路使 daf-16 参与细胞内抗氧化酶基因的表达，从而增强细胞的抗氧化能力并延长线虫的寿命35。本研究也表明，CGA 处理后，线虫体内 daf-16、gst-4 的表达量显著升高，daf-2 基因相对表达量下降，表明 CGA 可促进 daf-16 激活并上调下游基因的表达及通过调控 daf-2 和 gst-4 表达作用的结果，进而提升线虫对氧化的应激力。此外，gst-4 是氧化应激发生的关键因子，而氧化应激亦是外源化合物刺激的重要环节，CAT、SOD活性水平升高，减少大量氧自由基合成，可促进组织、胰岛素胰岛 细胞的生长，而减弱胰岛素抵抗36，因此，如何调节胰岛素信号通路活性，增强氧化应激对于改善线虫寿命至关重要。综上所述，100 mol/L CGA 饲喂线虫后，SOD 和 CAT 水平增加，体内的 daf-2 的表达量下降，同时daf-16、gst-4 表达量上调，得到结论：一定剂量的 CGA 可以延缓线虫的衰老并增强线虫抗氧化能力，可能通过调控胰岛素/类胰岛素信号通路调控相关基因的表达水平，增加抗氧化酶活力，有效减少脂褐素积累，使卡森斯氏线虫 0657L 线虫寿命得到延长。鉴于 CGA 的广泛应用和对人类健康的有益作用，后续试验过程中应进一步探究 CGA 对昆虫病原线虫运动能力、咽泵率、繁殖力和体型等影响，为延长昆虫病原线虫制剂货架期提供理论依据。参 考 文 献 1 Gems D,Pletcher S,Partridge L.Interpreting interactions between treatments that slow agingJ.Aging Cell,2002,1:1-9.2 Huang G,Mei X,Hu J.The antioxidant activities of natural polysaccharidesJ.Current Drug Targets,2017,18(11):1296-1300.3 Wu X,Li R,Zhao Y,et al.Separation of polysaccharides from Spirulina platensis by HSCCC with ethanol-ammonium sulfate ATPS and their antioxidant 第 1 期 陈红等：绿原酸对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫寿命及抗氧化活性的调控 115 activitiesJ.Carbohydrate Polymers,2017,173:465-472.4 Meng S X,Cao J,Feng Q,et al.Roles of chlorogenic acid on regulating glucose and lipids metabolism:a reviewJ.Evidence-based Complementary and Alternative Medicine:eCAM,2013,801457.5 Gems D.What is an anti-aging treatment?J.Experimental Gerontol,2014,58:14-18.6 Kenyon C J.The genetics of ageingJ.Nature,2010,464:504-512.7 Zemel M B.Modulation of energy sensing by leucine synergy with natural situin activators:effects on health spanJ.Journal of Medicinal Food,2020,23(11):1129-1135.8 Collins J J,Huang C,Hughes S,et al.The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegansJ.WormBook,2008,24:1-21.9 Kenyon C,Chang J,Gensch E,et al.A C.Elegans mutant that lives twice as long as wild typeJ.Nature,1993,366(6454):461-464.10 Dorman J B,Albinder B,Shroyer T,et al.The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegansJ.Genetics,1995,141(4):1399-1406.11 Blackwell T K,Steinbaugh M J,Hourihan J M,et al.SKN-1/Nrf,stress responses,and aging in Caenorhabditis elegansJ.Free Radical Biology and Medicine,2015,88(PtB):290-301.12 Zheng S,Huang X,Xing T,et al.Chlorogenic acid extends the lifespan of caenorhabditis elegans via Insulin/IGF-1 signaling pathwayJ.The Journals of Gerontology.Series A,Biological Sciences and Medical Sciences,2017,72(4):464-472.13 杨秀芬,杨怀文.昆虫病原线虫的致病机理J.中国生物防治,1998,14(4):38-42.14 Toepfer S,Kurtz B,Kuhlmann U.Influence of soil on the efficacy of entomopathogenic nematodes in reducing Diabrotica virgifera in maizeJ.Journal of Pest Science,2010,83:257-264.15 Bal H K,Grewal P S.Lateral dispersal and foraging behavior of entomopathogenic nematodes in the absence andpresence of mobile and non-mobile hostsJ.PLoS ONE,2015,10(6):e0129887.16 Kim D K,Jeon H,Cha D S.4-Hydroxybenzoic aid-mediated liespan extension in Caenorhabditis elegansJ.Journal of Functional Foods,2014,7:630-640.17 Yuan Y,Kang N,Li Q,et al.Study of the effect of neutral polysaccharides from Rehmannia glutinosa on life span of Caenorhabditis elegansJ.Molecules,2019,24(24):4592.18 谷黎娜.甘肃省昆虫病原线虫区系及优良品系生物学特性研究D.兰州:甘肃农业大学,2008.19 Uitrakul S,Hutton C,veal G J,et al.A novel imaging fow cytoometry method for the detecion of histone H4 acetylaton in myeloid cellsJ.European Jounal of Cliical Investigation,2019,49(7):e1315.20 Wan X,Li X,Liu D,et al.Physicochemical characterization and antioxidant effects of green microalga Chlorella pyrenoidosa polysaccharide by regulation of micro RNAs and gut microbiota in