角质形成细胞Wnt5a调控MMP9参与CRPS-Ⅰ型外周敏化机制研究.pdf

协 和 医 学 杂 志 基金项目：国家自然科学基金（）引用本文：朱贺，闻蓓，许力，等 角质形成细胞 调控 参与 型外周敏化机制研究 协和医学杂志，（）：论 著角质形成细胞 调控 参与 型外周敏化机制研究朱 贺，闻 蓓，许 力，黄宇光中国医学科学院北京协和医院麻醉科，北京 通信作者：许 力，：黄宇光，：【摘要】目的 探究皮肤角质形成细胞 通过靶向调控基质金属蛋白酶 （，）的表达参与复杂区域疼痛综合征（，）型外周敏化的机制，寻找该慢性疼痛的潜在治疗策略。方法 本研究分为两部分，第一部分为体外实验。体外培养人永生化角质形成细胞 进行氧糖剥夺 复氧（，）处理，初步观察 早期（内）线粒体损伤及膜电位变化，并探究给予不同浓度 抑制剂 对 的影响。第二部分为动物实验。将大鼠随机分为慢性缺血后疼痛（，）组、（）组、（）组和对照组，每组 只，组、（）组、（）组先建立大鼠患肢缺血再灌注 模型，模拟 型病理生理过程，（）组和（）组在此基础上分别足底注射 和 溶液 ，对照组和 组则分别注射生理盐水。通过疼痛行为学测定观察 组大鼠 周内不同时间点（，）机械痛和热痛阈值变化情况。染色观察大鼠皮肤炎症浸润及角化情况，免疫荧光染色观察 组 的表达情况，检测 组背根神经节（，）的 及肿瘤坏死因子 （，）水平。结果 体外实验：细胞进行 处理后，平均荧光强度显著增加（）；透射电镜下观察到 组出现线粒体明显萎缩，线粒体膜电位检测显示，与对照组相比，组提示线粒体膜电位下降明显（）。动物实验：与 组相比，仅 （）组线粒体膜电位上升具有统计学差异（）。行为学检测发现 组大鼠术后各时间点（，）机械痛阈值和热痛阈值均显著降低（均）。染色提示 组大鼠患足真皮层出现大量炎症细胞浸润，表皮出现过度角化，颗粒层及棘层厚度显著增加（）。免疫荧光试验显示，组角质形成细胞 荧光强度显著增加（）；与 组相比，（）组（）和 （）组（）荧光强度均显著下降。检测结果显示，组 （）和 浓度（）显著升高；与 组相比，（）组（）和浓度（）显著下降。结论 外周局部缺血再灌注损伤可导致角质形成细胞 过度表达，引起 型外周敏化。靶向抑制 可逆转 大鼠疼痛行为，为临床治疗慢性痛提供了参考依据。【关键词】复杂区域疼痛综合征；角质形成细胞；外周敏化【中图分类号】；【文献标志码】【文章编号】（）：，：，：，：协 和 医 学 杂 志 ，【】（），（）（）（，）（），（），（）（）（）（）（）（）（），：，（），（），（）（）：（，）（），（）（），（）（）（）（）（）（），（）（）（），【】；：（），（）：复 杂 区 域 疼 痛 综 合 征（，）是一种继发于创伤或基础疾病后，主要发生于四肢且顽固难治的疼痛综合征，常伴有区域性自主神经功能紊乱、运动功能受损、组织营养不良及微循环变化（水肿、体温调节障碍）等。在人群中的发生率为 万人年，根据其与交感神经的关系，可分为型（无明确神经损伤）和型（伴明确神经损伤证据），其病理机制尚未明确，临床治疗效果较差。信号通路在神经发育中对细胞增殖分化起重要作用，不同特异性配体结合 （卷曲蛋白）受体和共受体 （低密度脂蛋白受体家族）通过依赖 （连环蛋白）的经典信号通路和非经典信号通路发挥生物学效应，其中关键性 配体可通过调控神经损伤修复及炎症反应参与慢性疼痛的发生。基质金属蛋白酶（，）不仅可切割水解组织蛋白，还可降解炎症因子、趋化因子以及神经递质受体等。近期研究发现，在脑损伤、神经退行性疾病、胶质瘤及慢性疼痛进展中发挥重要作用。等研究指出，表皮生长因子受体通过激活 及 通角质形成细胞 调控 参与 型外周敏化机制研究 路增强伤害性感受。此外，基于 患者血液组织的蛋白互作网络及富集分析发现差异基因 在炎症反应中扮演重要角色。等研究发现，敲低内源性 能够抑制肿瘤坏死因子（，）诱导的 水平升高，从而抑制类风湿关节炎中成纤维样滑膜细胞引起的炎症反应。因此，可能是介导疼痛外周敏化的重要靶点之一。本研究通过对人永生化角质形成细胞 进行氧糖剥夺 复氧（，）处理及建立大鼠患肢缺血再灌注慢性缺血后疼痛（，）模型（模拟 型），探讨角质形成细胞 通过靶向调控 进而参与 外周敏化的机制，旨在为临床治疗 提供指导依据。材料与方法 实验材料 动物成年雄性 （）大鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。本研究已通过北京协和医院实验动物福利伦理委员会审批（审批号：）。材料及主要试剂 由国家生物医学实验细胞资源库（）提供，（抑制剂，美国），培养基（）（，美国），胎牛血清（，美国），青霉素链霉素（，美国），（，英国），试剂盒（，碧云天 生 物 公 司，中 国），角 蛋 白 （，英国），苏木素伊红染色试剂盒（，碧云天生物公司，中国），酶联免疫吸附测定试剂盒（，茁彩，中国），酶联免疫吸附测定试剂盒（，茁彩，中国）。分组与干预 体外实验将生长状态良好的 细胞取对数生长期接种于 孔板，并随机分为 组、（）组、（）组和对照组。损伤模型建立：弃去完全培养基后，润洗 次，添加无糖培养基及厌氧包置于细胞培养箱 ，之后更换高糖培养基进行复糖复氧。动物实验 大鼠适应性饲养 周后，随机分为 组、（）组、（）组和对照组，每组 只。组、（）组、（）组先建立缺血再灌注 模型：采用 （）戊巴比妥腹腔注射麻醉，将内径 型环套入大鼠右后肢踝关节处，造成肢端缺血，后剪断 型环，模拟缺血后再灌注过程。参考体外细胞实验给药剂量并稀释药物浓度，对照组和 组分别抽取生理盐水 ，（）组和 （）组分别抽取 和 溶液 ，于大鼠右后肢足底中间完成皮下注射。观察指标及具体方法 早 期（内）观 察 角 质 形 成 细 胞 线粒体损伤及膜电位变化。通过疼痛行为学测定观察不同处理组 周内不同时间点 第 天（），机械痛和热痛阈值变化情况。染色观察大鼠皮肤炎症浸润及角化情况，免疫荧光染色观察不同处理组 表达情况，检测不同处理组背根神经节（，）及 水平。线粒体膜电位测定向生长状态良好的 细胞中加入 染色工作液，于细胞培养箱中 孵育 ，之后离心 （，），用 染色缓冲液洗涤沉淀细胞 次，再用适量 染色缓冲液重悬后，用荧光显微镜观察。正常状态下 聚集在线粒体基质中，形成聚合物 （红色荧光）；当线粒体受损而膜电位下降时，无法聚集在线粒体基质中而呈现单体状态 （绿色荧光）。使用 软件计算绿色 红色荧光强度相对比例以分析线粒体膜电位变化情况。机械痛阈值测定将大鼠单独放置于可自由活动的透明有机玻璃笼内，底部为金属网底，适应 后，用 垂直刺激大鼠右后足底中部，缓慢用力至出现突然缩足、舔足或扬足反应为阳性。每足至少测量 次，每次至少间隔 ，取平均值作为机械缩足反射阈值。热痛阈值测定将大鼠单独放置于可自由活动的玻璃透明笼中，适应 后，用热辐射疼痛刺激仪照射大鼠右后足底，大鼠产生快速缩足、舔足或扬足反应为阳性，记录照射持续时间。每足至少测量 次，间隔 协 和 医 学 杂 志 ，以上，取平均值作为热刺激缩足反射的潜伏期。免疫荧光染色取出制作好的皮肤冰冻切片，室温干燥 ，用含 的 漂 洗 次，每 次，用含 的 室 温 孵 育，山羊血清抗体封闭液室温封闭 ，孵育一抗过夜（，）。皮肤切片室温平衡 ，漂洗 次，室温下避光孵育二抗 山羊抗鼠 （）（）和 山 羊 抗 兔 （）（），漂洗 次，含 的封片剂封片，荧光显微镜下观察拍照。染色在 时间点麻醉大鼠并将其处死，快速取患足皮肤。经不同浓度的乙醇溶液进行逐级脱水，二甲苯澄清，进行浸蜡、包埋切片制作，染色后凝胶密封，置于显微镜下观察。检测用预冷的 冲洗 组织，加入相应蛋白酶抑 制 剂 充 分 混 合 后，在 冰 上 研 磨。将 匀 浆 液离心 ，取上清检测。标准品孔各加不同浓度的标准品 。样本孔中加入待测组织。每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体，并 用 封 板 膜 封 孔。恒 温 箱 温 育 后每孔加满洗涤液 并静置 ，重复洗板 次。每孔加入相应底物并避光孵育 。加入终止液 后在 波长处测定各孔的 值并计算相应组织浓度。统计学处理采用 软件（，）进行统计学分析，并用 软件作图。痛阈值等符合正态分布的计量资料以均数标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较选用 检验。以 为差异具有统计学意义。结果 细胞 后 表达变化对生长状态良好的 细胞进行缺氧及无糖培养基处理 ，与对照组相比，组 荧光强度显著增加（）；与 组相比，（）组（）及 （）组（）相对荧光强度均显著下降，不同浓度 抑制剂组间比较差异无统计学意义（），见图。图 细胞 后不同处理组角质形成细胞 表达变化（标尺，）（，）（）：氧糖剥夺 复氧角质形成细胞 调控 参与 型外周敏化机制研究 对 细胞 后线粒体影响透射电镜下观察 细胞 后早期出现线粒体明显萎缩，线粒体嵴发生形态结构紊乱。荧光探针检测显示，与对照组相比，组绿 红荧光比例显著增加（），提示线粒体膜电位下降；与 组相比，（）组线粒体 膜 电 位 有 所 上 升，差 异 具 有 统 计 学 意 义（），见图。大鼠 后行为学改变与对照 组 相 比，组 大 鼠 术 后 各 时 间 点（，）机械痛阈值和热痛阈值均 显 著 降 低（均 ）；与 组 相 比，（）组在 和 时间点机械痛阈值改善具有统计学差异（），在，和 时间点热痛阈值明显上升（）。（）组与 （）组在 和 时间点机械痛阈值差异具有统计学意义，而热痛阈值在各个时间点均无明显差异，见图。后患足表皮 染色及免疫荧光染色 时间点麻醉后，处死大鼠并取材患足皮肤进行图 抑制剂 对 细胞线粒体影响 透射电镜下 组线粒体萎缩情况（标尺）；染色检测各组线粒体膜电位变化（标尺，）（）；（，）：同图 协 和 医 学 杂 志 ，图 大鼠建模给药流程图（）及造模后疼痛行为学改变（）（）（）（）：慢性缺血后疼痛；与对照组比较，；与 组比较，染色。与对照组相比，组大鼠患足真皮层出现大量炎症细胞浸润，表皮出现过度角化，颗粒层及棘层厚度显著增加（）；与 组相比，（）组 颗 粒 层 及 棘 层 厚 度 降 低 明 显（），见图。时间点麻醉后处死大鼠并取材患足皮肤进行免疫荧光试验。与对照组相比，组角质形成细胞 荧光强度显著增加（）；与 组相比，（）组（）和 （）组（）荧光强度均显著下降，不同浓度组间比较无统计学差异（），见图。大鼠 后 组织炎症因子改变 时间点麻醉后处死大鼠取 组织，法检测炎症因子 及 浓度。与对照组相比，组 （）和 浓度（）显著升高；与 组相比，（）组（）和 浓度（）显著下降，见图。讨论 是重要的慢性疼痛综合征之一，其病理生理机制较为复杂，近年来是疼痛领域的研究热点。目前大量研究证实 信号通路中关键性配体 在慢性疼痛机制中发挥重要作用，但其是否与 的发生相关尚无研究报道。等研究指出 常作为炎性反应的下游产物而在慢性疼痛进展过程中显著升高，其中以 和 升高尤为明显。同样，等研究发现，靶向抑制 的活性可有效抑制坐骨神经损伤引起的神经病理性疼痛。本研究以此为切入点，通过体外、动物双重实验，探究角质形成细胞 通过调控 参与 的外周敏化机制。参与调控线粒体膜电位 等研究表明，体外培养的星形胶质细胞进行 处理后 表达显著上升，体内胰高血糖素样肽 受体激动剂 能够降低 的表达，进而保护血脑屏障。同样，本研究发现 细胞 后 表达明显上升，特异性抑制剂 能够显著降低 的荧光强度，然而不同浓度（和 ）间未发现统计学差异，尚需进一步探究。处理早期会产生活性氧（，），的过度积累能够导致线粒体膜通透性增加，进而引起线粒体跨膜电位降低，表现为线粒体萎缩及细胞色素 释放，诱导细胞凋亡的发生并激活凋亡蛋白酶，进一步导致炎症和疾病的产生。本研究通过透射电镜发现在 细胞 早期（内）线粒体出现明显萎缩，线粒体嵴发生形态结构损伤，采用 荧光探针检测线粒体膜电位发现 组电角质形成细胞 调控 参与 型外周敏化机制研究 图 后患足表皮 染色及免疫荧光染色结果（）大鼠患足表皮 染色；大鼠患足表皮免疫荧光染色（标尺）（）；（）：同图 图 大鼠 后 组织、水平改变 ：同图 协 和 医 学 杂 志 ，压显著下降，给予 能够抑制膜电位电压的下降，可能与阻断 的过度积累有关。抑制剂逆转痛觉敏化 临床主要表现为自主神经症状（出汗、血管舒缩功能异常）、运动障碍和营养性改变（皮肤、骨骼萎缩、毛发减少、关节挛缩）等。慢性缺血后疼痛模型 是目前国际上公认的 动物模型，通过延长缺血时间（），能够完全模拟型患者病理生理过程。等研究发现，降低小鼠体内 水平能够显著抑制 小鼠的神经性疼痛和神经炎症，缓解患足的机械超敏反应。本研究发现，建模后各时间点（，）机械痛阈值和热痛阈值均明显下降，通过局部注射 抑制剂能有效缓解大鼠的慢性疼痛。染色显示，组大鼠患足真皮层出现大量炎症细胞浸润，建模早期大鼠患足出现明显肿胀，后期表皮出现过度角化，颗粒层及棘层厚度显著增加，而 （）组角化程度较低。调控 参与 外周敏化目前，被认为是参与神经炎症的关键因子，在多种动物模型中证实其可以通过对细胞因子等的剪切活化，触发下游信号通路的激活导致神经病理性疼痛的产生。本研究发现，大鼠患足缺血再灌注损伤后角质形成细胞上 表达显著上调，抑制剂能够降低 的表达同时逆转痛觉超敏反应，但未发现降低程度存在剂量依赖性。等研究发现，类风湿关节炎小鼠靶向敲除 后，和 的表达显著降低，炎症细胞浸润程度改善，软骨破坏活动受到抑制。同样，等指出，由脂多糖诱发人支气管上皮细胞 和人脐静脉内皮细胞 导致的炎症反应可被 拮抗剂 和 所抑制，炎症因子 、及 随之下降，降低程度与 抑制剂呈剂量依赖性。因此，靶向抑制 信号通路的激活将有效抑制炎症的持续进展，一定程度缓解 患者的慢性疼痛。本研究主要关注外周敏化在 病理生理过程中发挥的重要作用，其中 信号通路的激活及炎症反应发挥重要作用。此外，本研究 结果提示 组大鼠 水平 及 浓度显著升高，局部外周注射高浓度 抑制剂能够有效抑制炎症的持续进展。然而，通过何种路径被 激活，其上行至中枢的具体机制尚需实验进一步探究。综上，通过体内体外双重实验，本研究初步证实外周局部缺血导致皮肤角质细胞 的过表达，引发持续性外周敏化，导致 型的发生。局部应用 抑制剂可逆转 的过度表达及大鼠疼痛行为，靶向抑制外周 可为临床治疗该慢性痛提供参考依据。作者贡献：朱贺负责实验设计、实验实施和论文撰写；闻蓓负责图表制作及数据分析；许力、黄宇光负责研究设计、论文修订与最终审核。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献，：，（）：，：，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，角质形成细胞 调控 参与 型外周敏化机制研究 ，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：（收稿：录用：在线：）（本文编辑：李 娜）