金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响.pdf
《金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响.pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、40(1)61-70 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 2 月 收稿日期:2022-11-29 基金项目:国家重点研发计划(2022YFD1400505,2021YFD1000500,2017YFD0201205);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(S2022XM11,Y2022LM31)作者简介:王苗苗,硕士,E-mail:;*通信作者,研究员,E-mail:。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.11.005 金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响 王苗苗1,3,王广君1,农向群1
2、*,蔡 霓1,刘 蓉1,宋红岩2,涂雄兵1,张泽华1(1.中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害综合治理全国重点实验室,北京 100193;2.内蒙古锡林郭勒盟农牧技术推广中心,锡林浩特 0260003;3.宁波盈农利德贸易有限公司,宁波 315100)摘要:丝状真菌的 fluG 基因参与调控分生孢子的生成,然而在昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中 fluG 的作用鲜有研究报道。本研究利用 DNA 同源重组方法,构建敲除 fluG 的金龟子绿僵菌突变株,分析突变株的产孢特性。以苯菌灵抗性基因 ben 作为筛选标记,fluG 基因侧翼序列作为同源臂,构建了打靶载体pDHt/sk-fluG-Ben。利用
3、 PEG 介导将打靶载体转化金龟子绿僵菌的原生质体,获得了苯菌灵抗性转化子。根据靶基因和标记基因检验,确定获得了敲除 fluG 的金龟子绿僵菌突变株。表型分析显示,fluG 突变株继代培养 5 代仍保持苯菌灵抗性,菌落呈疏松毛絮状,生长相较野生型明显缓慢,不能或者仅能产生极少量分生孢子。说明 fluG 基因的敲除影响了菌株生长发育,并阻止了分生孢子形成,是金龟子绿僵菌产孢调节的重要基因。本研究为阐述金龟子绿僵菌产孢调控机制提供依据。关 键 词:基因敲除;fluG 基因;产孢调控;同源重组;昆虫病原真菌 中图分类号:S476.1 文献标识码:A 文章编号:1005-9261(2024)01-00
4、61-10 Effects of fluG Gene Knockout on Sporulation in Metarhizium anisopliae WANG Miaomiao1,3,WANG Guangjun1,NONG Xiangqun1*,CAI Ni1,LIU Rong1,SONG Hongyan2,TU Xiongbing1,ZHANG Zehua1(1.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection,Chinese Academy
5、of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China;2.Inner Mongolia Xilingol Agricultural and Animal Husbandry Technology Extension Center,XilinHot 026000,China;3.Ningbo Yingnonglide Trading Co.,Ltd,Ningbo 315100,China)Abstract:The fungal gene fluG is involved in the regulation of conidial generation.How
6、ever,the role of fluG in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is rarely reported.To investigate the role of fluG in M.anisopliae,we constructed a mutant strain of M.anisopliae with fluG knocked out by DNA homologous recombination to analyze its effect on the sporulation characteristics
7、.The target vector pDHt/sk-fluG-Ben was constructed by using benomyl resistance gene ben as selective marker and sequence of fluG gene flanks as homologous arms.The target vector was transformed into the protoplasts of M.anisopliae by PEG mediating,and the resistant transformants of benomyl were obt
8、ained.According to the test of target genes and marker genes,the mutant strains of M.anisopliae with fluG knocked out were determined.Phenotypic analysis showed that the fluG mutant still maintained benomyl resistance after 5 generations of subculture.The mutant colonies looked loose and flocculent,
9、grew significantly slower than the wild type,and could not or only produce a very small number of conidia.These results indicate that the knockout of fluG gene affect the development of the strain and prevent conidia formation,showing fluG an important gene in the regulation of spore-producing of M.
10、anisopliae.This study establishes the basis for further elaborating the regulation mechanism of M.anisopliae conidiation.62 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 Key words:gene knockout;fluG gene;sporulation regulation;homologous recombination;entomopathogenic fungus 昆虫病原真菌金龟子绿僵菌 Metarhizium anisopliae 是研发真菌杀虫剂的重要
11、资源,主要以高毒力作为筛选潜力菌株的指标,而菌株的产孢性能也是评价真菌杀虫剂潜力的重要因素,研究产孢的调控有利于提高菌株产孢量和菌剂生产效率。有研究报道,真菌的 fluG 基因参与调控分生孢子的生成。构巢曲霉 Aspergillus nidulans fluG 基因具有光适应性、参与菌丝发育与产孢形成的调控,其编码的 FL 蛋白是产孢基因的重要调控因子,在真菌的发育繁殖过程中起着不可或缺的作用1,2。分生孢子的形成由基因 brlA、abaA、wetA 组成的中央途径结合其他多基因形成的网络来调控,而 fluG 处于中央调控途径的上游,已证明 fluG 通过激活 brlA 来调控产孢3,4,也可
12、以通过消除 sfgA(编码一种 N 端有 gal4 型 Zn(II)2Cys6 双核簇 DNA 结合基序的蛋白)抑制产孢作用来达到调控5。在粗糙脉孢霉 Neurospora crassa 和布拉克须霉 Phycomyces blakesleeanus 中也存在这种光适应和 fluG 基因调控产孢的现象6,7。笔者前期的研究表明,金龟子绿僵菌培养至 4872 h 的临近产孢和初期产孢阶段,fluG 基因表达量出现上升,而且能够感应蓝光增加 fluG 基因的表达量,提高产孢量8。为了探讨金龟子绿僵菌 fluG 基因的作用,笔者已完成了金龟子绿僵菌 IPPM010202 菌株的 fluG 基因克隆和
13、生物信息学分析,通过 Southern Blot 证明该基因在染色体中为单拷贝,还筛选得到适合该菌株的苯菌灵抗性标记基因 ben。本研究拟利用 DNA 同源重组方法,构建敲除 fluG 的突变株,分析突变株的产孢特性,明确 fluG 基因对金龟子绿僵菌分生孢子形成的作用,为阐述金龟子绿僵菌产孢调控机制、促进生物杀虫剂研发提供依据。1 材料和方法 1.1 生物材料 金龟子绿僵菌 IPPM010202 菌株由本实验室保存。菌株 fluG 基因由笔者前期克隆和检验,保存于本实验室。大肠杆菌 Escherichia coli Trans1 T1 感受态细胞购自北京全式金生物公司;质粒 pDHt/SK
14、由中国农业科学院植物保护研究所蒋细良研究员惠赠;质粒 pBIPT-Ben 由本研究室构建保存。1.2 主要试剂和培养基 DNA 提取试剂盒、EX Taq DNA 聚合酶、PCR 产物胶回收试剂盒、T4 DNA 连接酶、DNA Marker、Hind III、Xba I、Apa I 等限制性内切酶,蜗牛酶、PEG8000 等均购自北京六合通生物技术有限公司。T 载体 pGEM-T Easy Vector Systems 购自 Promega 公司。除非特别说明,试剂反应条件均按照试剂说明书进行。其他试剂有卡那霉素、琼脂糖、指示剂、培养基等,均为市售进口或国产分析纯,苯菌灵为 98%原药。金龟子绿
15、僵菌培养基(PSAY):每 1000 mL 含新鲜土豆 200 g 煮汁,蔗糖 20 g、酵母浸出粉 5 g。固体加琼脂 20 g。大肠杆菌培养基(LB):每 1000 mL 含葡萄糖 5 g,蛋白胨 10 g,酵母膏 5 g,氯化钠 10 g。固体加琼脂 20 g。STC buffer:蔗糖 200 g,1 mol/L Tris-Hcl(pH 8.0)50 mL,CaCl2 5.55 g,定容至 1000 mL。PTC buffer:PEG8000 40 g,1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)5 mL,CaCl2 0.555 g,加热溶解后定容至 100 mL,用 0.45 m
16、 滤器过滤除菌。TB3 buffer:3 g 酵母浸出粉,3 g 酪蛋白氨基酸,200 g 蔗糖,加水至 1000 mL。原生质体再生培养基,上层:TB3 溶液中加卡那霉素 50 g/mL,苯菌灵 10 g/mL,低熔点琼脂糖 0.75%;下层:TB3 溶液中,加苯菌灵 10 g/mL,低熔点琼脂糖 0.75%。除 PTC,所用培养基和溶液均用高压蒸汽灭菌。1.3 双元打靶载体的构建 通过 DNA 同源重组方法,将目标基因 fluG 两侧翼序列连接到筛选标记苯菌灵抗性基因 ben 两侧,使之能够与金龟子绿僵菌基因组中同源片段发生特异性结合,导致筛选标记基因与目标基因发生同源替换,实现 fluG
17、 敲除。第 1 期 王苗苗等:金龟子绿僵菌 fluG 基因的敲除及对产孢的影响 63 1.3.1 目的基因 fluG 的两翼同源片段的克隆 采用染色体步移法,根据 fluG 基因近两端序列分别设计侧翼序列特异性引物(表 1),在引物 5-TYBF/5-TYBR 上游添加 Apa I 酶切位点、下游添加 Hind III 酶切位点;在引物 3-TYBF/3-TYBR 上游、下游分别添加 Xba I 酶切位点。以金龟子绿僵菌基因组 DNA 为模板,扩增 fluG 两侧翼序列,反应体系为 10PCR Buffer 5 L,dNTP mix 4 L,Primer 1(10 pmol/L)2 L,Pri
18、mer 2(10 pmol/L)2 L,金龟子绿僵菌基因组 1 L,Ex Taq 酶 0.25 L,ddH2O 35.75 L。反应程序见表 2。将扩增获得的目标产物经电泳分离后回收,连接到 T 载体,转化 E.coli Trans1 T1,利用蓝白斑筛选阳性克隆菌落,并测序(北京英骏生物技术公司)确认。提取质粒,获得含有侧翼同源序列 5-TYB和 3-TYB 质粒。表 1 试验所用引物 Table 1 Specific primers in experiment 名称 Name 序列 Sequence(5-3)目的 Intention 5-TYBF AATGGGCCCGTCCCATGCGTT
19、CCTGT 5-TYBR CCCAAGCTTTGTTGACTTTGCCACCG 扩增 5端同源臂 3-TYBF GCTCTAGAAATTCCACATCAAGCATCAA 3-TYBR GCTCTAGAGTCCGTAAGAGCCTAGCGAC 扩增 3端同源臂 BenF TTCTCTTTCTTTTCCCATCT BenR CCTCAGTGTAGTGACCCTTG 扩增抗性基因 ben FG-1F ATGGACCAAGGCTTTCAGGCT FG-1R GACACCAGGAATCAAGACATCA 基因敲除验证 表 2 fluG 基因侧翼序列 PCR 扩增程序 Table 2 PCR amplif
20、ication procedure of fluG flanking sequence 5 端侧翼 5 end flank 3 端侧翼 3 end flank 步骤 Steps 温度 时间 温度 时间 1 94 5 min 94 5 min 2 94 1 min 94 1 min 3 68 1 min 35 C 56 1min 35 C 4 72 1 min 72 1 min 20 s 5 72 10 min 72 10 min 1.3.2 打靶载体构建过程 按图 1 所示步骤,首先根据质粒 pDHt/SK 和 pBIPT-Ben 序列上共有酶切位点,利用Hind III和Xba I分别双酶切
21、载体pSHt/sk和pBITP-Ben,反应体系为10 mol/L buffe 2 L,Hind III 1 L,Xba I 1 L,pSHt/sk 或 pBITP-Ben 16 L,反应过程 37 1 h。琼脂糖电泳后回收,获得线性载体和苯菌灵抗性基因 ben 的表达框;利用 T4 DNA 连接酶将二者连接,得到含有 ben 表达框的载体 pSHt/sk-Ben,然后转化 E.coli Trans1 T1 感受态,通过卡那抗性平板筛选,挑取单菌落,质粒酶切检验后保存。第二步,先用 Apa I 分别酶切载体 pSHt/sk-Ben 和含有侧翼同源序列的 5-TYB 质粒,反应体系为 10 mo
22、l/L buffer 2 L,Apa I 2 L,5-TYB 质粒或 pSHt/sk-Ben 16 L,电泳后回收目的片段,再用 Hind III 分别酶切(10 mol/L buffer 2 L,Hind III 2 L,5-TYB 质粒片段或 pSHt/sk-Ben 片段 16 L)并回收,然后用 T4 DNA 连接酶将二者连接,获得 pSHt/sk-Ben-5载体。第三步,用 Xba I 酶切含有侧翼同源序列的 3-TYB 质粒,反应体系为 10 mol/L buffer 2 L,Xba I 2 L,3-TYB 质粒或 pSHt/sk-Ben-5载体 16 L;同时利用 Xba I 酶切
23、 pSHt/sk-Ben-5载体,去磷酸化,反应体系为 DNA 片段 20 L,10 mol/L buffer 5 L,细菌碱性磷酸酶 2 L,ddH2O 23 L,获得载体框;将 3侧翼同源片段与载体框连接。最后转入 E.coli Trans1 T1 感受态,通过卡那抗性平板筛选阳性转化子,并测序检验。将连接正确的转化子扩大培养,提取质粒,最终获得双元打靶载体 pDHt/sk-fluG-Ben。1.4 打靶载体转化金龟子绿僵菌 1.4.1 金龟子绿僵菌原生质体制备与再生培养 接种金龟子绿僵菌培养至 36 h,过滤后留菌丝体,用 0.7 mol/L 64 中 国 生 物 防 治 学 报 第 4
24、0 卷 图 1 双元打靶载体 pDHt/sk-fluG-Ben 的构建 Fig.1 The construction of targeting vector pDHt/sk-fluG-Ben NaCl 溶液离心洗涤 3 次;取少量新鲜菌丝体加入到 20 mL 胞壁酶解液(含蜗牛酶 0.2 g,0.7 mol/L NaCl)中,于 30 80 r/min 解离 3 h;用 Mirocloth 过滤,留取滤液,4000 r/min 离心 15 min,去上清;用 0.7 mol/L NaCl 重悬,离心清洗两次后,用 STC buffer 清洗两次,重悬后在显微镜下计数,调终浓度至 2107510
25、7/mL,备用。检测原生质体再生率。将原生质体悬液稀释至 2103/mL,取 200 L 接种涂布于底层再生培养基上,重复 3 皿。以接种无菌水低渗处理的原生质体为对照,于 28 培养 3 d 后计菌落数,计算再生率。再生率(再生菌落数对照菌落数)/(21030.2)100%。1.4.2 打靶载体转化原生质体 取原生质体 200 L 于 1.5 mL 离心管中,加不同浓度梯度的打靶载体pDHt/sk-fluG-Ben 质粒,缓慢上下吹打混匀后,室温静置 20 min;加入 1.25 mL 的 PTC 溶液,颠倒混匀,室温静置 20 min,促进原生质体对质粒 DNA 的渗透吸收;加入 5 mL
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 金龟子 绿僵菌 fluG 基因 影响
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。