了哥王叶绿体基因组分析.pdf
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1、了哥王叶绿体基因组分析吴民华1,叶晓霞1,谭靖怡2,梁秋婷3,吴子健3,黄琼林1(1.广东医科大学基础医学院,广东湛江524023;2.广东医科大学药学院,广东湛江524023;3.广东医科大学第一临床医学院,广东湛江524023)摘要:【目的目的】阐明药用植物了哥王 Wikstroemia indica 的叶绿体基因组结构特点及系统进化地位,为了哥王的资源保护和可持续利用提供科学依据。【方法方法】采用 Illumina 测序平台进行了哥王叶绿体基因组测序,并通过生物信息技术和软件进行序列拼接、注释以及比对和系统进化分析。【结果结果】了哥王叶绿体基因组全长为 149864bp,由 86347b
2、p 的大单拷贝区(LSC)、10601bp 的小单拷贝区(SSC)以及穿插在它们之间均为 26458bp 的一对反向重复区(IR)构成,具有环状双链四分体结构,包含 124 个基因。在了哥王叶绿体基因组中共找到 64 种 24180 个密码子,其中 30 种为高频使用密码子,高频使用密码子中又有 29 种是以 A/T 结尾;搜索到 93 个简单重复序列(SSR),其中单核苷酸重复居多(72 个),且以 A 或 T 及两者组合形成的基序为优势基序。了哥王与近缘植物的叶绿体基因组 IR 边界存在较为明显的变异。序列比较和系统进化树显示了哥王与同属细轴荛花 W.nutans 具有最高的序列同源性。【
3、结论结论】了哥王叶绿体基因组具有植物叶绿体基因组的典型结构,有密码子使用偏好性,含多态性较为丰富的 SSR,且与细轴荛花的亲缘关系最近。图 5 表2 参 24关键词:了哥王;叶绿体基因组;密码子偏好性;简单重复序列;序列比对;系统进化关系中图分类号:S722.3文献标志码:A文章编号:2095-0756(2024)02-0297-09AnalysisonchloroplastgenomeofWikstroemia indicaWUMinhua1,YEXiaoxia1,TANJingyi2,LIANGQiuting3,WUZijian3,HUANGQionglin1(1.SchoolofBasi
4、cMedicine,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,Guangdong,China;2.SchoolofPharmacy,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,Guangdong,China;3.TheFirstClinicMedicalCollege,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,Guangdong,China)Abstract:ObjectiveThisstudyisaimedtoclarifythestructuretraitsof
5、chloroplastgenomeandphylogeneticstatus of medicinal plant Wikstroemia indica,providing a scientific basis for the resource protection andsustainableutilizationofW.indica.MethodAnIlluminahigh-throughputsequencingplatformwasemployedtoacquirethechloroplastgenomesequencewhichwasthenassembled,annotated,c
6、omparedandanalyzedusingbioinformaticstechnologiesandsoftware.ResultThechloroplastgenomeofW.indicawasanannularquadripartitemoleculewithalengthof149864bpandcomposedofalargesinglecopy(LSC,86347bp),asmallsinglecopy(SSC,10601bp)andacoupleofinvertedrepeat(IR,26458bp)and124geneswereannotatedinthechloroplas
7、tgenome.Inthechloroplastgenometherewereatotalof24180codon,whichweredivided into 64 types of which 30 types of codon were used frequently and 29 of them ended with A/T.Altogether93chloroplastsimplesequencerepeat(SSR)wereidentifiedfromthechloroplastgenomewith收稿日期:2023-07-24;修回日期:2023-12-13基金项目:广东省基础与应
8、用基础研究基金项目(2018A030310116);广东省大学生创新创业训练计划项目(S202310571113);广东医科大学大学生创新创业训练计划项目(GDMU2022113,GDMU2022125)作者简介:吴民华(ORCID:0000-0003-4454-5507),从事中药分子药理研究。E-mail:。通信作者:黄琼林(ORCID:0000-0001-5248-8253),副教授,博士,从事医学生物化学研究。E-mail:浙江农林大学学报,2024,41(2):297305Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.20
9、95-0756.20230412Mononucleotide being the predominate type taking up a number of 72 and the motifs formed by A/TcontributingthemostandobviousvariationswereobservedinIRboundarybetweenW.indicaandcloselyrelatedplantswhereassequencealignmentandphylogenetictreerevealedthatW.indicasharedhighsequenceidentit
10、ywithW.nutans.ConclusionThechloroplastgenomeofW.indicaexhibitedtypicalstructureofplantchloroplastgenome,andpossessedcodonpreferenceandseveralSSRswithrichpolymorphism.Additionally,thechloroplastgenomeofW.indicashowedtheclosestsimilaritytoW.nutans.Ch,5fig.2tab.24ref.Key words:Wikstroemia indica;chloro
11、plast genome;codon preference;simple sequence repeat;sequencealignment;phylogeneticrelationship叶绿体基因组为植物质体遗传体系之一,是由大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSC)以及穿插在它们之间的一对碱基组成相同、排列方向相反的反向重复区(IR)构成的环状双链四分体,通常编码约130 个主要与光合作用以及叶绿体自身复制相关的基因12。叶绿体基因组是研究植物物种鉴别、进化生物学和遗传多样性的新思路,并且已有较多的应用实例。SONG 等3比较了 27 种安息香属 Styrax 植物的叶绿体基因组序列,筛
12、选出 6 个高突变序列,其中 ycf1b 和 trnT-trnL 是安息香属物种鉴别的特异性DNA 条形码。LIU 等4利用叶绿体基因组序列探讨了 11 种燕麦属 Avena 植物的系统进化关系,支持燕麦属的单系性,并且认为该属包括 2 个遗传支系。JO 等5基于饲料作物大花野豌豆 Vicia bungei 的叶绿体简单重复序列(SSR)开发出 232 个分子标记,并将其中 39 个分子标记应用于野豌豆属 Vicia 中 7 个物种的遗传多样性分析。了哥王 Wikstroemia indica 是瑞香科 Thymelaeaceae 荛花属 Wikstroemia 常绿灌木植物,全株有毒,分布于
13、中国广东、广西、海南、福建、湖南、浙江、云南、贵州、四川以及台湾等大部分省区,多见于海拔1500m 以下开旷的林下或石山上,野生时一般分布在山坡灌木丛中或路边、村边等6。了哥王的干燥根及根皮可入药,能清热解毒、消肿散结、止痛,多用来治疗支气管炎、肺炎、乳腺炎等多种炎症以及跌打损伤7,已被开发成了哥王片、了哥王胶囊、了哥王颗粒、祛伤消肿酊等制剂。了哥王含有黄酮、木质素、香豆素、甾体、挥发油等化学成分,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性89。了哥王根叶煮汁可作杀虫剂,茎皮纤维可以制作高级纸张和人造棉6。了哥王还是一种观赏性园林植物10。因此,了哥王具有较高的药用、经济和社会价值。了哥王原以野
14、生采收为主要来源,随着市场需求的快速增加,了哥王遭到过度开采,不少产地的野生蕴藏量急剧下降,出现资源匮乏甚至枯竭的情况11。本研究分析了哥王叶绿体基因组序列的结构和基因组成、密码子偏好性、SSR 等特征,比较了哥王与近缘植物的叶绿体基因组序列差异,并基于叶绿体基因组探究了哥王的进化位置,旨在为了哥王的品种鉴定、育种栽培、遗传背景和系统进化等资源保护和可持续利用提供科学依据。1材料与方法1.1了哥王的采集和处理了哥王植株于 2022 年 6 月采自广西壮族自治区钦州市钦北区,经广东医科大学天然药物研究与开发重点实验室吴科锋研究员鉴定。取了哥王植株的新鲜叶片,使用北京康为世纪生物科技公司生产的磁珠
15、法植物 DNA 提取试剂盒提取了哥王的总 DNA,随后采用美国 Illumina 公司生产的 NexteraXTDNA 测序文库制备试剂盒构建了哥王的叶绿体基因组测序文库。1.2叶绿体基因组测序、拼接、基因注释和图谱绘制通过美国 Illumina 公司的 Novaseq6000 高通量测序平台完成了哥王叶绿体基因组测序。测得的原始序列经滤除试剂盒附带的接头序列和含有无法确定碱基的劣质序列后,获得合格的可分析读序。采用SPAdes 软件对可分析读序进行序列拼接,并运用 plastidgenomeannotator 软件对序列中含有的基因进行功能注释。拼接和注释后的了哥王叶绿体基因组序列和基因信息
16、提交至 GenBank 保存(序列登记号为OQ831641),并提交到 OGDRAW 在线工具(https:/chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)绘制物理图谱。298浙江农林大学学报2024 年 4 月 20 日1.3密码子偏好性和 SSR 分析参照黄琼林12的研究,采用 CodonWv1.3 软件计算了哥王叶绿体基因组全部密码子的相对同义密码子使用情况(RSCU)值,评价其使用频率,RSCU1 为高频使用密码子。参照吴民华等13的研究,使用 MISA 软件(https:/webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)检索了哥王
17、的 SSR,分析其类型、组成基序、数量和分布等特点。1.4序列比对分析利用 IRscope 在线软件(https:/irscope.shinyapps.io/irapp/)比较了哥王与同属植物细轴荛花 W.nutans(MW393702)、荛花 W.canescens(MW073911)、头序荛花 W.capitate(MW073909)以及同科植物长柱瑞香 Daphne championii(MT648376)叶绿体基因组 IR 边界(即 IR 贴近相邻 LSC 或 SSC 的碱基)的位置差异。采用设置为 Shuffle-LAGAN 模式的 mVISTA 软件(https:/genome.l
18、bl.gov/vista/index.shtml)进行前述5 种瑞香科植物叶绿体基因组的多重序列比对,明确它们之间的碱基差异。1.5系统进化分析为探究了哥王在荛花属和瑞香科内的进化关系,在 GenBank 中下载已公开发布的瑞香科及其相关类群菱科 Trapaceae、桃金娘科 Myrtaceae 植物叶绿体基因组序列,并以与了哥王亲缘关系较远的单子叶植物高良姜 Alpinia officinarum 的叶绿体基因序列作为外群,将所有下载序列与本研究测得的了哥王叶绿体基因组序列一起提交到 MAFFT 软件进行多重比对及对齐,随后导入设置为 GTRGAMMA 模型的RAxML 软件构建系统进化树。
19、2结果与分析2.1叶绿体基因组的结构和基因特点如图 1 所示:了哥王叶绿体基因组由位于 186347bp 的 LSC、86348112805bp 的 IRA、112806123407bp 的 SSC 和 123408149864bp 的 IRB 依顺时针排列而成,呈现为 149864bp 的环状双链四分体分子。了哥王叶绿体基因组的 GC 含量较低,仅为 37.5%。从表 1 可见:了哥王叶绿体共有 124 个基因,包括 79 个蛋白质编码基因、8 个核糖体 RNA 基因和37 个转运 RNA 基因。这些基因中有 14 个基因(trnK-UUU、rps16、trnG-UCC、atpF、rpoC1
20、、trnL-UAA、trnV-UAC、petB、petD、rpl16、rpl2、ndhB、trnI-GAU、trnA-UGC)含有 1 个内含子,1 个基因(ycf3)存在 2 个内含子;17 个基因(ndhB、rps7、rpl2、rpl23、ycf1、ycf2、rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23、trnI-CAU、trnL-CAA、trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU)具有 2 个拷贝。2.2密码子偏好性分析通过 CodonW 软件,在了哥王叶绿体基因组的编码区共找到 24180 个密码子,包括 24100 个氨基酸编码密码子和
21、 80 个终止密码子。如图 2 所示:61 种氨基酸编码密码子编码 20 种氨基酸,终止密码子有 3 种。编码相同氨基酸的多种密码子即称为同义密码子,除了甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)外,其余 18 种氨基酸均有 26 种同义密码子。除了 AUG(单独编码 Met)和 UGG(单独编码 Trp)的 RSCU 为1 外,有 30 种密码子的 RSCU1,为高频使用密码子;其余 32 种密码子的 RSCU1,属于低频使用密码子。在 30 种高频使用密码子中,有 29 种的第 3 位碱基是 A/T,表明了哥王叶绿体基因组偏好使用A/T 结尾的密码子。2.3SSR 分析以设定的参数通过 MISA
22、 软件查找,在了哥王叶绿体基因组中发现 93 个 SSR,由 72 个单核苷酸、11 个二核苷酸、4 个三核苷酸、5 个四核苷酸以及 1 个五核苷酸组成(表 2)。在各类 SSR 中,A/T、AT/AT、AAT/ATT、AAAT/ATTT、AATAG/ATTCT 分别是优势基序,数量依次是 72、9、3、3、1 个,分别占单核苷酸的 100.0%、二核苷酸的 81.2%、三核苷酸的 75.0%、四核苷酸的 60.0%和五核苷酸的100.0%。可见,由 A/T 及组合形成的基序数量最多,分别包括 72 个单核苷酸、9 个二核苷酸、3 个三核苷酸、4 个四核苷酸,共占 SSR 总数的 94.6%。
23、因此,了哥王以 A/T 及组合形成的 SSR 居多,与其叶绿体基因组低 GC 含量的情况相符。在分布区域上来看,了哥王 SSR 主要分布在 LSC,而 SSC 和 IR 较少;从所有位置上来看,这些 SSR 主要位于基因间隔区(IGS),基因内含子次之,编码区(CDS)则最第 41 卷第 2 期吴民华等:了哥王叶绿体基因组分析299少。说明了哥王叶绿体 SSR 分布广泛且不均匀,多态性较为丰富。2.4IR 边界比较叶绿体基因组的 2 个 IR 在邻近 LSC、SSC 的位置形成边界,分别称作 JLB(IRB-LSC)、JSB(IRB-SSC)、JSA(IRA-SSC)和 JLA(IRA-LSC
24、)。如图 3 所示:了哥王等 4 种荛花属植物的 JLB 均处于 rpl19 和rpl2 之间的 IGS,瑞香属 Daphne 植物长柱瑞香的 JLB 则在 rpl16 内。了哥王的 JSB 在 ycf1 内,细轴荛花的 JSB 在 ycf1 和 rpl132 之间的 IGS,其余植物的 JSB 则在 ndhF 内。了哥王和细轴荛花的 JSA 都在ycf1 内,且都在距离该基因 5端的 1085bp 处,其余植物的 JSA 则在 rpl132 和 trnL 之间的 IGS。了哥王等 4 种荛花属植物的 JLA 均落在 rpl2 和 trnH 之间的 IGS,长柱瑞香的 JLA 则位于 rps3
25、 和 trnH 之间的IGS。由此可见,了哥王与其他 4 种植物的 IR 边界存在较为明显的差异(尤其是 JSB),说明叶绿体基因组在了哥王等瑞香科植物进化过程中发生了不同程度的 IR 扩张和收缩。2.5序列比对如图 4 所示:了哥王与细轴荛花的序列相似度最高,仅在 psbE-petL、atpF-atpH 等 IGS 看到少量的碱基突变,并且编码区的序列完全一致。了哥王与另外 2 种荛花属植物荛花、头序荛花有着较明显的序列差异,几乎所有的 IGS、内含子等非编码区序列均可见碱基突变,而且 psbA、trnK-UUU、rpoC2、rpoC1、rpoB、accD、rpoA 等多个基因也可见变异。了
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