声动力治疗巨噬细胞通过促进atp释放趋化单核细胞科研训练论文1大学论文.doc
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1、哈尔滨医科大学七年制学生基础阶段科研论文病理生理学教研室单位代码:10226学号:2009172057分类号: 2009172033 2009172075哈尔滨医科大学七年制学生基础阶段科研训练论文题 目 : 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 学科、专业 : 病理生理学教研室 学 生 姓 名: 曹博然 张翰 赵雪竹 指 导 教 师: 田野 教授 指 导 研 究 生: 孙鑫 郭淑媛 陈海波 二一二年七月目 录目 录1中文摘要2Abstract3文献综述5前 言12材料与方法13技术路线15结 果16讨 论19结 论21致 谢21参考文献22中文摘要目 的:证明声动力治疗(sono
2、dynamic therapy,SDT)巨噬细胞能够趋化单核细胞的聚集并探讨其机制。方 法:将实验对象分为对照组、SDT组、ATPase组及SDT-ATPase组。其中对照组为单纯THP-1源性巨噬细胞,而SDT组是在对照组基础上加入终浓度为15g/ml的5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid, ALA),孵育2小时后接受声动力治疗。ATPase组及SDT-ATPase组则是分别在对照组和SDT组基础上加入ATPase。将实验对象离心后取其细胞上清液并分别用transwell方法研究其对单核细胞的趋化作用;将实验对象分为对照组、SDT组、zVAD-fmk组及SDT-zVAD
3、组。其中对照组为单纯THP-1源性巨噬细胞,SDT组是在对照组基础上加入 ALA,孵育2小时后接受声动力治疗。zVAD-fmk组及SDT-zVAD组则是分别在对照组和SDT组基础上加入N-苯甲基氧化碳酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮(zVAD-fmk)。将实验对象离心后,分别用荧光素酶方法检测细胞上清及细胞内ATP量的变化。结 果:用transwell方法研究声动力治疗后的细胞上清对单核细胞的趋化作用时,从募集的单核细胞数量来看,声动力治疗组明显高于对照组(p0.05);用荧光素酶方法,检测声动力治疗巨噬细胞后及加入凋亡抑制剂后细胞上清及细胞内ATP量的变化得出:声动力治疗组明显高于对照
4、组,约为其3倍(p0.05)。 结 论:声动力治疗巨噬细胞通过促进凋亡相关的ATP释放趋化单核细胞 关键词:ATP 动脉粥样硬化 声动力疗法 巨噬细胞AbstractPurpose: This paper is designed to investigate the effects of monocytes recruitment after sonodynamic therapy and delve into its mechanism.Methods: The subjects were divided into four groups: The control group,the SDT
5、 group, the ATPase group and the SDT-ATPase group.The control group merely contains THP-1 derived macrophages.The SDT one,containing macrophages and sonosensitizer ALA ,was incubated with fresh medium for 6 h before being exposed to pulse ultrasound irradiation. The ATPase group was a mixture of the
6、 control group and ATPase. Similarly,the SDT-ATPase group , was comprised of the SDT group and ATPase. Cell-free supernatants from each group were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes in a transwell migration assay.For a further study of ATP concentrations changes, we use another fo
7、ur groups of subjects: The control group(macrophages alone),the SDT group, the zVAD-fmk group(added caspase-inhibitor zAVD-fmk ) and the SDT-zAVD group(like the SDT group pretreated with zAVD-fmk).Supernatants and cell debris after high speed centrifugation from these four groups were investigated r
8、espectively.Results: Cell-free supernatants with SDT were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes in a transwell migration assay. The SDT group induced an approximately sixfold greater recruitment of monocytes than the control group did(p0.05). Luminometer was used to measure the chang
9、e of ATP content.The ATP concentration of the SDT group was increased about therefold in comparison with the control group (p0.05).Conclusions: This study demonstrates that SDT could induce the recruitment of monocytes by promoting the release of ATP in THP-1 macrophages via caspase-dependent pathwa
10、y .Key words: ATP, atherosclerosis, sonodynamic therapy, macrophages文献综述 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种多因性疾病,近年来,尽管AS的诊断与治疗有了长足的进步,但人们对其病因学的认识仍然不足。既往和晚近提出的AS发病学说,如血栓形成学说、脂质浸润学说、单克隆学说、损伤反应学说、剪切应力学说、同型半胱氨酸学说、精氨酸学说、内皮功能紊乱学说、氧化应激学说等都不足以完全解释AS的发病基础1。近年来的基础研究与临床研究结果提示,AS炎症学说应重新受到重视。有充分的证据显示,在AS性疾病的不同临床表现形式
11、中,炎症参与其发生和发展的所有环节2。这一发现,为临床治疗AS提供了理论依据及研发新药提供了新思路。1. 巨噬细胞凋亡与动脉粥样硬化近年的研究表明,动脉粥样硬化病灶内脂质中心的大小、炎细胞尤其是巨噬细胞的数量、纤维帽的厚薄及新生血管的多少是决定斑块稳定与否的最主要的因素,而巨噬细胞则通过对斑块内脂质含量、炎症反应、纤维成分的降解及新血管形成等方面来影响动脉粥样硬化病变的进展,从脂质条纹的发生到最终斑块破裂和血栓形成,巨噬细胞在动脉粥样硬化的所有阶段都起着极其重要的作用。1.1巨噬细胞凋亡在动脉粥样硬化不同病变阶段的机制及作用近年来,细胞凋亡在动脉粥样硬化的形成和进展中的作用日渐成为研究热点,斑
12、块破裂伴血栓形成是造成动脉粥样硬化临床急性症状的主要原因,而大量的细胞凋亡直接造成斑块不稳定3,凋亡过度是不稳定斑块的明显特征。据相关报道,在斑块的不同区域凋亡率具有一定的差别,富含巨噬细胞区细胞凋亡通常要高于其他区域4。斑块的“肩部”最容易发生破裂,纤维帽薄,含有大量激活的巨噬细胞,并存在凋亡残体及许多内含凋亡细胞的巨噬细胞和淋巴细胞,凋亡细胞和凋亡残体对巨噬细胞具有强烈的化学趋化活性,而巨噬细胞本身也遭受细胞凋亡所释放的细胞因子的影响而发生凋亡。巨噬细胞的吞噬作用在动脉粥样硬化不同的病变阶段有着很大的差异,所以在病变早期和晚期其凋亡对动脉粥样硬化的影响是不同的。在病变早期,巨噬细胞吞噬功能
13、很强,主要针对脂蛋白,也可有效清除凋亡细胞,其表达的TG2不但能促进凋亡细胞的清除,而且能限制活体内动脉粥样硬化病变的大小5,因此,动脉粥样硬化早期巨噬细胞凋亡可减少病变成分而抑制病变进展6。巨噬细胞能表达多种清道夫受体(scavenger receptor, SR),包括SR-A、SR-BI、CD36、CD68及SR-E(LOX-1)等,它迁入内膜后能通过其表面的SR摄取氧化修饰后的脂蛋白,绝大多数脂蛋白被转运到溶酶体中消化并降解为氨基酸和游离胆固醇,过多的游离胆固醇以胆固醇酯的形式储存在胞质里,从而转变为泡沫细胞7。粥样坏死中心的形成与泡沫细胞的聚集和凋亡密切相关。研究表明,斑块脂质中心有
14、巨噬细胞抗体CD68的表达,说明坏死物中有巨噬细胞的残片,这也间接支持粥样坏死中心是在泡沫细胞聚集凋亡的基础上形成的。而且,斑块中的脂质越多,其纤维帽中的巨噬细胞及T淋巴细胞也越多,说明粥样坏死可能在单核细胞向内膜迁入过程中起一定的促进作用。在成熟病变中,吞噬细胞吞噬血小板、红细胞、凋亡细胞及脂蛋白,其中对凋亡细胞的吞噬有利于斑块的稳定,清除凋亡细胞的能力可能对急性粥样血栓性临床事件起决定作用6。但晚期病变中,许多因素可引起吞噬细胞清除凋亡细胞的功能受损,导致斑块内坏死、炎症及血栓形成8。斑块中细胞大量凋亡不仅直接造成脂质中细胞数量的减少,而且由于巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡后形成的凋亡物质难以清
15、除,发生继发性坏死和炎症反应,细胞膜完整性破坏,脂质为主的胞浆内容物释放后堆积形成脂质池,从而促进斑块脂质中心的形成并逐渐增大。因此,在动脉粥样硬化晚期,巨噬细胞的凋亡对斑块的稳定是不利的。加强巨噬细胞整体的吞噬功能并非完全有益,然而选择性加强其对凋亡细胞的摄取,可能有助于动脉粥样硬化病变的抑制。1.2斑块中巨噬细胞凋亡与血管平滑肌细胞凋亡的相互关系在动脉粥样硬化斑块中发现血管平滑肌细胞和巨噬细胞都经历着凋亡与坏死,而凋亡占主导地位。血管平滑肌细胞分散于粥样病灶内皮下纤维部分及斑块纤维帽深部中膜的下层,而巨噬细胞成簇分布于内皮下、富含脂质的病灶中心和纤维帽的肩部。因此,平滑肌细胞源性泡沫细胞的
16、凋亡主要发生在纤维区,而巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡主要发生在病变的脂质核心处,后者比前者更易发生凋亡,特别是在脂质核内和脂质核周围,在脂质核的非细胞部分可发现其凋亡残留物。平滑肌细胞凋亡和巨噬细胞凋亡对动脉粥样硬化病变的意义不同,在斑块易损部位平滑肌细胞凋亡能引起纤维帽的强度减弱,平滑肌细胞凋亡只是斑块破裂的一个征兆,并非会直接导致斑块破裂,平滑肌细胞凋亡不可能通过纤维帽变薄来促进斑块破裂9。有研究报道,巨噬细胞分泌的Fas配体可诱导血管平滑肌细胞凋亡10,而血管平滑肌细胞凋亡也可增加巨噬细胞凋亡,由于这能减少巨噬细胞因过度表达基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,
17、MMP)而对细胞外基质的破坏,所以有利于斑块的稳定11。1.3巨噬细胞与动脉粥样硬化的治疗动脉粥样硬化是多因素作用的复杂病变,在其发生发展中巨噬细胞有着重要的作用,抑制巨噬细胞内脂质聚集、减轻炎症反应,以及选择性调控其凋亡程序将成为动脉粥样硬化新的有效的治疗手段。目前临床上已有多种对抗动脉粥样硬化的治疗方法,如降脂治疗、他汀类药物的应用及血管源性细胞活素疗法等,都直接或间接地影响着巨噬细胞的凋亡。相信,随着蛋白组学和基因芯片等技术的逐步完善,我们将会对动脉粥样硬化中巨噬细胞的凋亡进行更有利的调控,从而使动脉粥样硬化有更好更广阔的临床治疗前景。 2. 声动力治疗 2.1声动力治疗的概况 1989
18、年国际超声学会议上,日本学者Umemura S首次提出了SDT这一概念。SDT是指对肿瘤患者静脉注射声敏剂后,应用一定频率和强度超声作用于肿瘤部位,使聚集在肿瘤部位声敏剂产生抗肿瘤因子从而对肿瘤细胞进行杀伤,抑制肿瘤的进一步生长。SDT有其独特的优越性:无创性、超声治疗装置简单易操作、靶向治疗、特异性强、副作用小。 2.2声动力治疗的机制SDT作用机制目前仍不清楚,主要的有超声空化效应、自由基理论、单线态氧机制等。 2.2.1超声空化效应超声空化效应是指液体中的微小气泡(空穴) 在声波作用下所发生的振荡、扩大、收缩乃至崩溃等一系列动力学过程,从而产生如化学反应、发光、次谐波等现象。 2.2.2
19、自由基理论自由基理论认为由于超声的空化作用激活空化泡内或临近的光敏剂,通过直接热分解弱键或与水热分解形成的H 和OH 反应产生光敏剂来源的自由基,自由基与O2 反应形成烷氧自由基和过氧基对有机溶液中的有机分子反应活性低,更容易到达靶细胞而发挥作用14。2.2.3单线态氧机制超声过程中超声空化导致声致发光,光激活空化泡内或临近的光敏剂分子而产生单线态氧。 O2 具有细胞毒性作用,其较大的扩散半径,能穿透线粒体膜,参与电子传递和氧化作用;能穿透核膜,造成DNA 的损伤;导致胞膜脂质过氧化而杀伤细胞等。2.3声敏剂目前研究中所使用的声敏剂主要分为三类15:卟啉类化合物、抗炎药物、抗癌症药物。理想的声
20、敏剂不但要求化学纯性、有效的声敏化作用,还要对靶组织有较好的选择性,对人体毒副作用小,可以迅速的从体内排除等,目前认为较好的声敏剂仍是以卟啉类为主。卟啉类化合物作为声敏剂用于临床诊断和治疗恶性肿瘤已有20多年,其能在肿瘤部位聚集,卟啉由通过超声产生的能量转移给电子而激发,产生具有细胞毒性的自由基。ALA 属于第二代光敏剂。与其他光敏剂相比,具有光毒性副作用小,用药后避光时间短,渗透性好,对组织深层病变的疗效和选择性更佳等优点,成为目前光动力治疗领域研究的方向和热点。ALA是一简单的五碳化合物,多以盐酸盐形式存在。分子式为C5H9NO3HCl,为白色或微黄色针状结晶或粉末, 能溶于水和乙醇,极微
21、溶于乙醚和乙酸乙酯。它是人体血红素代谢的内源性前体物质, 体内代谢途径见图116。ALA在各种酶的激活下生成原卟啉(Pp),原卟啉是血红素内源性合成代谢途径中的一种前体,其化学结构如图222所示。细胞内的Pp是一种很强的光敏物质,最大吸收峰值位于630 nm,光敏毒副反应小,是重要的光动力治疗药物。Pp是一种非常有效的光敏剂,它在一定波长的光照射下,发生化学反应, 产生单重态氧和氧化物, 引起细胞膜、线粒体和核酸的损伤,使病变细胞坏死、凋亡,从而起到治疗疾病的作用17。图1 ALA体内代谢途径Fig1.The metabolic pathway of ALA in vivoB图2. 声敏剂分子
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