激酶筛选在药物研发中检测手段及应用.pdf
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1、195临床研究 2023 年 11 月第 31 卷第 11 期作者简介:赵亚,本科。研究方向:新药研发早期筛选。Med,2001,16(9):606-613.50PLUMMER F,MANEA L,TREPEL D,et al.Screening for anxiety disorders with the GAD-7 and GAD-2:a systematic review and diagnostic metaanalysisJ.Gen Hosp Psychiatry,2016,39:24-31.51YANG Y A,DING R J,HU D Y,et al.Reliability a
2、nd validity of a Chinese version of the HADS for screening depression and anxiety in psycho-cardiological outpatientsJ.Compr Psychiatry,2014,55(1):215-220.52MORISKY D E,ANG A,KROUSEL-WOOD M,et al.Predictive validity of a medication adherence measure in an outpatient settingJ.J Clin Hypertens,2008,10
3、(5):348-354.53司在霞,郭灵霞,周敏,等.修订版Morisky服药依从性量表用于抗凝治疗患者的信效度检测J.护理学杂志,2012,27(22):23-26.临床荟萃激酶筛选在药物研发中检测手段及应用赵亚男,王晶(北京爱思益普生物科技股份有限公司,北京 100023)摘要:由激酶和磷酸酶介导的可逆蛋白磷酸化在调节细胞增殖、凋亡、亚细胞易位、炎症和代谢等细胞功能方面起着关键作用。人类激酶组由 518 种蛋白激酶组成,由于蛋白结构域序列相似性,主要分成酪氨酸激酶(TK)、酪氨酸激酶样(TKL)、STE 组激酶家族(STE)、CMGC 组蛋白激酶(CMGC)、蛋白激酶 A,G,C(AGC)
4、、非典型蛋白激酶组(PIKK)、脂质激酶(PI3K)和其他激酶组等 8 个家族,人类蛋白激酶约占总基因的 1.7%,并介导真核细胞中大多数的信号传导,通过将三磷酸腺苷(ATP)的-磷酸转移到底物蛋白上的保守丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基来调节细胞的生理过程,因此蛋白激酶成为药物筛选和药物干预的重要靶标。关键词:激酶;激酶谱;筛选方法中图分类号:R914.1文献标志码:B DOI:10.12385/j.issn.2096-1278(2023)11-0195-04Detection and Application of Kinase Screening in Drug DevelopmentZHAO
5、Yanan,WANG Jing(Beijing Aisipu Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 100023,China)Abstract:Reversible protein phosphorylation mediated by kinases and phosphatases plays a key role in regulating cellular functions such as proliferation,apoptosis,subcellular translocation,inflammation,and metabolism.The huma
6、n kinome is composed of 518 protein kinases,which are mainly divided into eight families due to the sequence similarity of protein structural domains:tyrosine kinase(TK),tyrosine kinase-like(TKL),STE kinase family(STE),CMGC protein kinase(CMGC),protein kinase A,G,C(AGC),atypical protein kinase group
7、(PIKK),lipid kinase(PI3K)and other kinase groups.Human protein kinases account for about 1.7%of the total genes and mediate most of the signal transduction in eukaryotic cells.They regulate cellular physiological processes by transferring the-phosphate of adenosine triphosphate(ATP)to the conserved
8、serine,threonine or tyrosine residues of substrate proteins.Therefore,protein kinases have become important targets for drug screening and drug intervention.Key Words:kinase;kinome;screening method1激酶筛选方法介绍由于蛋白激酶家族规模较大,从而许多针对野生激酶及突变体的高通量筛选技术已经被广泛开发。激酶作为多数细胞通路的关键调节因子,作为疾病的致病因子或治疗干预点,然而如何选择分析方式、分析平台以及
9、分析技术也就成为了一项挑战。我们在分析过程中需要考虑成本、效率、试验方法的便捷性、低概率的假阳性和假阴性结果1。蛋白激酶代表了人类基因中最大的药物靶点。蛋白激酶的过度表达或失调导致许多疾病2。根据小分子激酶抑制剂临床试验信息3显示,目前正在探索大约 110 种新激酶作为靶点,加上大约 45 种已批准的激酶抑制剂靶点,仅占人类激酶组约 30%,这表明仍有大量可开发的激酶药物靶点。目前市面上激酶筛选根据检测方式的不同分为基于生物功能分析(Functionassay)和化合物结合竞争分析(Bindingassay)两类。激酶功能测定是基于激酶活性的测定,直接或者间接定量催化产物的生成,例如磷酸化底物
10、、二磷酸腺苷(ADP)或者-磷酸。激酶结合试验是定量的测定小分子和激酶蛋白的结合,而不是测定磷酸化的产物,在测定目标分子结合亲和力方面是很有价值的。1.1结合的检测方法介绍及优缺点目前市面上测结合的方法有:KinomeScanTM激酶测试和 LanthaScreenTMEu 结合测试。1.1.1 Kinome ScanTM激酶测试化合物结合激酶活性位点直接或间接的阻止激酶和固定化配体结合,这将减少在固定化配体上的激酶数量4。相反不结合激酶的测试分子对在固定化载体上捕获的激酶数量没有影响。筛选结合的方式是通过使用定量的检测 DNA 标签的 qPCR 的方法。这种方法不需要三磷酸腺苷(ATP),提
11、供真正的热力学亲和数据,而不是 IC50(半抑制浓度),可检测多种抑制剂类型,如型、型和变构抑制剂,有较大的检测动态范围,用于精确的亲和测量,可以测定激活状态196Clinical Research,Nov.2023,Vol.31 No.11特异性,提供抑制剂结合模式信息,数据准确并可重复。目前已经覆盖了 80%以上的人类蛋白激酶组,包括蛋白激酶 A、G、C(AGC)、钙离子(Ca2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CAMK)、CMGC组蛋白激酶(CMGC)、酪蛋白激酶 1(CK1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)、酪氨酸激酶(TK)、酪氨酸激酶样(TKL)、脂质和非典型激酶家族、病原体激酶、和
12、重要的疾病相关突变形式。1.1.2 Lantha ScreenTMEu 结合测试LanthaScreenTMEu 结合测试是“示踪剂”和抗体与激酶的结合导致高度的荧光共振能力转移(FRET)值,使用激酶抑制因子代替“示踪剂”则可以造成低值。同其他激酶活性实验相比,此实验是简单的“混合与读取”检测,不需要展开步骤。Invitrogen 公司的激酶示踪剂是适用检测任何结合到ATP 位点或者结合到能改变 ATP 构象的异构位点化合物。结合到 ATP 位点的抑制因子包括仅结合在 ATP 位点上的型激酶抑制因子和既结合 ATP 位点也结合暴露在DFG-out(非活性构象)疏水位点的型抑制因子。与活性实验
13、不同,激酶结合实验在激酶处于活性状态或非活性状态下都能进行,很适于检测型抑制因子。在某些情况下,除了型抑制因子,也能观察到型和型抑制因子选择性结合到特异性活性位点。可实现激酶抑制因子的灵敏检测,检测活性和非活性激酶,实时跟踪慢速结合的抑制因子,比较抑制因子开关,无底物特异性,但无法检测结合非激酶结构域的抑制剂。1.2Function 方法的介绍及优缺点功能分析平台的检测方式包括辐射、荧光、发光和迁移转移分析。具体测试方法有:Z-LYTEassay、迁 移 率 分 析(MobilityShiftassay)、均 相 时 间 分 辨 荧光(HTRF)、ADP 含 量 测 试(ADP-Gloassa
14、y)、同 位 素分析法(33PanQinaseassay)和热点分析(HotSpotassay)1.2.1Z-LYTEAssayZ-LYTEassay 基于荧光共振能量转移(FRET)的方法,不需要昂贵的放射性或抗体试剂。在多肽底物的两端分别标记了发射的供体荧光分子(香豆素)和受体荧光分子(荧光素)。在多肽底物上加上磷酸基团,特异性蛋白酶识别并切割非磷酸化的多肽底物,导致荧光共轭能量转移不再发生。而未切割的磷酸化多肽维持荧光共轭转移。使用比率法计算用于定量反应进程。比率法减少了孔间 FRET 肽浓度和信号强度的变化,使得读值稳定。Z-LYTEassay 需要合成荧光基团标记的多肽底物,可以实现
15、化合物的快速检测开发,得到的检测结果稳定并可重复。此方法通过小型化试验来节省试剂和资金,若化合物本身有蛋白水解酶的抑制作用,可能会导致假阳性4。1.2.2MobilityShiftAssay迁移率偏移测定通过测量激酶反应中的非磷酸化和磷酸化底物直接监测磷酸化。根据选择的靶激酶评估化合物的效力和选择性。激酶反应后,部分底物被激酶加上磷酸基团成为产物,带有荧光标记的多肽底物和反应产物之间相差 3 个电荷,当进入毛细管电泳后,由于两者所携带的电荷不同而达到分离。当运行基于芯片的高通量筛选(HTS)方法分离荧光标记的多肽底物和反应产物,必须考虑为后续分析设置不同的抑制截止点,以避免失去太多潜在的靶点。
16、同样,在命中识别和确认方面存在 30%的差异,这对使用该方法进行分析工作构成了很大的挑战,特别是对于具有溶解度问题的化合物2。1.2.3HTRFAssay在多肽底物上标记的生物素能够与 XL665 标记的链合亲和素特异性结合。镧系元素标记的特异性磷酸化抗体能识别磷酸化多肽底物并结合。就能够形成一个XL665 标记的链合亲和素,磷酸化的多肽底物以及镧系元素 Eu 标记的磷酸化抗体三者结合的复合物。由于两者的距离较短,能够形成荧光共轭能量转移。镧系元素 Eu的荧光半衰期较长,可以应用于时间分辨荧光的检测5。供体铕以隐态形式而不是螯合形式存在,其包含一个笼在三联吡啶结构中的铕离子,并避免潜在的与其他
17、生物反应器试剂(如 Mn2+)竞争的螯合活性,并提高试剂在酸性条件下的稳定性。通过使用针对任一磷酸化底物的抗体,可以形成供体和受体。HTRF 分析具有低酶消耗和与大范围 ATP 浓度(高达 1mM)的兼容性等优点。体系稳定:一天内可随时检测,信号基本不变;无需包被,免洗 ELISA,省时省力;比值处理时可有效去除背景荧光,出现假阳性和假阴性概率降低,可去除由于天然产物自发荧光引起的背景值,但易受 ATP 酶的干扰,且不能测定细胞内激酶活性6。1.2.4ADP-GloAssay7在激酶反应后,加入 ADP-GloTM试剂消耗完剩余的ATP,再将 ADP 转化成 ATP 的同时,还使用偶联的萤光素
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