抗肿瘤药物体内筛选试验基础标准操作专项规程SOP.doc
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1、抗肿瘤药品体内筛选标准操作规程概述:抗肿瘤药品是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖一类药品,作用机制包含抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包含和抗肿瘤药品申请临床试验和申请上市相关非临床有效性和安全性研究内容,其中着力强调非临床有效性和安全性之间关联性,和非临床研究和临床试验之间关联性。意在首先为抗肿瘤药品非临床研究提供技术参考;其次,经过技术要求引导科学有序研发过程,使中国这类药品研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表现在对抗肿瘤药品非临床研究通常性认识。具体药品非临床研究应在本指导标准基础上,依据药品本身特点制订研究方案。研究
2、目标:建立一套包含抗肿瘤药品体内作用药效学研究和评价体系及对应标准操作规程和抗肿瘤药品安全性和作用新机制研究。 有效性研究抗肿瘤药品有效性研究目标关键在于探索受试物作用机制、作用强度、抗瘤谱等,为以后安全性评价和临床试验中适应症、给药方案选择提参考信息。 安全性评价安全性评价目标关键包含:(1)估算 I 期临床试验起始剂量;(2)估计药品毒性靶器官或靶组织;(3)估计药品毒性性质、程度和可逆性;(4)为临床试验方案制订提供参考。研究计划:(a)小鼠急性毒性测试 根据急性毒性测试常规方法,选择昆明种小鼠,经过腹腔注射方法给药,测定体外抗肿瘤活性突出化合物半数致死量(LD50),参考给药小鼠体重改
3、变情况,评价化合物急性毒性,并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试给药剂量。(b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 依据动物体内抗肿瘤活性测试标准方法,选择昆明种小鼠,皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株,选择体外活性突出且急性毒性较低化合物,设定适宜剂量经过腹腔注射方法给药,以临床常见抗肿瘤药品环磷酰胺作为阳性对照药品,测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。(c)专利保护范围内化合物继续合成申请保护范围较大专利,合成部分可能含有良好活性新化合物,拓展研究范围,发觉活性更强化合物,并申请新发明专利。并可针对具体化合物申请隶属专利,延长高活性化合物保护期限。(d)体外抗肿瘤活性广泛筛选 采取MTT法或台盼蓝染色法,
4、测定化合物对多个人肿瘤细胞株增殖抑制活性,确定化合物在不一样瘤株间抗肿瘤活性选择性,为裸鼠模型试验提供依据。(e)抗肿瘤作用机理深入研究 依据抗肿瘤(f)人癌裸鼠移植瘤模型试验活性化合物作用机理特征,选择微管蛋白聚合等试验从分子水平确定化合物作用机理;利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架影响及诱导凋亡途经,从细胞水平上说明化合物作用机理。 依据抗肿瘤新药审批措施要求,采取裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型,以相对肿瘤增值率和生存时间为指标,确定化合物抗肿瘤活性。(g)动物体内药品代谢动力学试验 选择在人癌裸鼠移植瘤模型试验中活性良好化合物,开展动物体内药品代谢动力学试验,考查化
5、合物吸收、分布、代谢、排泄性质。(h)动物亚急性,长毒试验 依据抗肿瘤新药审批措施要求,测定动物亚急性、长毒性质,进行药品安全性评价。基础方法:小白鼠灌胃法 以左手捉持小白鼠,使腹部朝上,右手持灌胃器。灌胃器先从小白鼠口角插入口腔内,然后沿着上颚壁轻轻插入食管,稍感有阻力时(大约灌胃管插入1/2,相当于食管过膈肌部位),即可推进注射器,进行灌胃(图1)。若注射器推进困难,应重插。若灌胃器误插入气管给药,可致小白鼠死亡。注药后轻轻抽出灌胃管。此法1次给药量为0.01-0.03ml/g。 图1.小白鼠捉持及其灌胃法小白鼠皮下注射法 通常在其背部皮下注射。将其皮肤拉起,注射针刺入皮下,把针尖轻轻左右
6、摆动,易摆动表示已刺入皮下,然后注射药液。拔针时,以手指捏住针刺部位,以预防药液外漏(图2)。该法对小白鼠1次注射药量为0.01-0.03ml/g。图2.小白鼠皮下注射法小白鼠静脉注射法 通常采取尾静脉注射法。事先将小白鼠或大白鼠置于固定筒内或铁丝罩内,或扣于烧杯内,使其尾巴露出(图3)。将尾置于45-50温水中浸泡或用75%酒精棉球擦之,以使血管扩张。然后,选择尾巴左、右两侧静脉进行注射。注射时若出现隆起白色皮丘,说明药品未注入血管。这时,注射器应向尾根部位移动,重新注射。该法对小白鼠1次注射量为0.005-0.01ml/g。图3小白鼠尾静脉注射法小白鼠腹腔注射法以左手捉持小白鼠,让其腹部向
7、上,右手将注射器针头刺入皮肤,刺入部位距离下腹部腹白线稍向左或右位置(图4)。向前推进注射器3-5mm,,接着使注射针和腹部皮肤面呈45刺入小白鼠腹肌,继续向前刺入,针头经过腹肌进入腹腔后阻力消失,这时即可慢慢注入药液。对小白鼠1次注射量为0.01-0.02ml/g。图4.小鼠腹腔注射法试验动物标识试验用较大动物如兔、猫、犬等可用特制号码牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠,可用黄色苦味酸(3%-5%)涂于毛上标号。其编号方法无统一要求,以下方法可供参考。如给小鼠标识1-10号,可将小鼠背部分前肢、腰部、后肢,按左、中、右分为九个区,从右到左标识1-9号,第10号不标识(图5a)。如给小鼠标识1
8、-20号,则(图b)。1号右前肢 11号腰部及右前肢2号左前肢 12号腰部及左前肢3号左后肢 13号腰部及左后肢4号右后肢 14号腰部及右后肢5号头部 15号腰部及头部6号头部及右前肢 16号腰、头部及右前肢7号头部及左前肢 17号腰、头部及左前肢8号头部及左后肢 18号腰、头部及左后肢9号头部及右后肢 19号腰、头部及右后肢10号腰部(背中间 20号尾根部图5.小鼠、大鼠皮毛标识编号法(a) 小鼠急性毒性测试目标:测定LD50了解受试物毒性强度、性质和可能靶器官,为深入进行毒性试验剂量和毒性观察指标选择提供依据,并依据LD50进行毒性分级。结果判定:如LD50小于人可能摄入量100倍,则放弃
9、该受试物。如LD50大于或等于100倍者,则可考虑进入下一阶段毒理学试验。 如动物未出现死亡剂量大于或等于10g/kg BW(涵盖人体推荐量100倍),则可进入下一阶段毒理学试验。 对人可能摄入量较大和其它部分特殊原料,按最大耐受量法给最大剂量动物未出现死亡,也可进入下一阶段毒理学试验。范围:本方法要求了急性毒性试验基础技术要求。术语和定义:下列术语和定义适适用于本方法。半数致死量(LD50)是经口给受试物后,预期能够引发动物死亡率为50%单一受试物剂量,该剂量为经过统计得出估量值。其单位是每千克体重所摄入受试物质毫克数、克数或毫升数,即mg/kg BW、g/kg BW 、mL/kg BW。最
10、大耐受剂量法(MTD):用最大使用浓度和最大灌胃容量给20只动物后,连续观察7-14天,未见任何动物死亡,则MTD大于*g/kg BW。原理经口一次性给或24h内数次给受试物后,在短时间内观察动物所产生毒性反应,包含致死和非致死指标参数,致死剂量通常见半数致死剂量LD50来表示。试验动物通常均分别用两种性别成年小鼠或大鼠。小鼠体重为18-22g,大鼠体重为180-220g。如对受试物毒性已经有所了解,还应选择对其敏感动物进行试验,如对黄曲霉素选择雏鸭。动物购置后适应环境3-5天。操作步骤受试物处理:受试物应溶解或悬浮于适宜介质中。通常采取水或食用植物油作溶剂,能够考虑用羧甲基纤维素、明胶、淀粉
11、等配成混悬液;不能配制成混悬液时,可配制成其它形式(如糊状物等)。必需时可采取二甲基亚砜。但不能采取含有显著毒性有机化学溶剂。如采取有毒性溶剂应单设溶剂对照组观察。受试物给路径:经口。试验前空腹:动物应隔夜空腹(通常禁食16h左右,不限制饮水)。容量:各剂量组灌胃容量相同(ml/kg BW),小鼠常见容量为20 mL/kg BW;大鼠常见容量为10ml/kg BW。 方法:通常一次性给受试物。也可一日内数次给(每次间隔4-6h,24内不超出3次,尽可能达成最大剂量,合并作为一次剂量计算)。常见急性毒性试验设计方法霍恩氏(Horn)法预试验:可依据受试物性质和已知资料,选择下述方法:通常多采取0
12、.1、1和10g/kg BW剂量,各以2-3只动物预试。依据24内死亡情况,估量LD50可能范围,确定正式试验剂量。也可简单地采取一个剂量,如215mg/kg BW,用5只动物预试。观察24h内动物中毒表现。如症状严重,估量多数动物可能死亡,即可采取低于215mg/kg BW剂量系列,反之症状较轻,则可采取高于此剂量剂量系列。如有对应文件资料时可不进行预试。动物数:通常每组用5只。常见剂量系列: 1.002.1510t t=0,1, 2, 34.64因为剂量间距较1.00/3.1610t t=0,1, 2, 3为小,所以结果较为正确。通常试验时,可依据上述剂量系列设计)个组,即较原来方法在最低
13、剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组,这么在查表时轻易得出结果。 正式试验:将动物在试验动物房喂养观察3-5天,使其适应环境,证实其确系健康动物后,进行随机分组。给受试物后通常观察7或14天,若给后第4天继续有死亡时,需观察14天,必需时延长到28天。统计死亡数,查表求得LD50,并统计死亡时间及中毒表现等。 该方法优缺点:优点是简单易行,节省动物;缺点是所得LD50可信限范围较大,不够正确。但经多年来实际应用和验证,同一受试物和寇氏法所得结果极为相近。所以对其测定结果应认为是可信和有效。 最大耐受量试验:适宜条件:相关资料显示毒性极小或未显示毒性受试物,给动物最大使用浓度和最大灌胃容量受试物
14、时,仍不出现死亡。 动物:最少雌、雄各10只。剂量:受试物最大使用浓度和灌胃容量(一个剂量组)。方法:动物购置后观察3-5天,给最大使用浓度和最大灌胃容量受试物(一日内1次或数次给,一日内最多不超出3次),连续观察7-14天,动物不出现死亡,则认为受试物对某种动物经口急性毒性剂量大于某一数值(g/kg BW)。最大灌胃容量小鼠为20 mL/kg BW,大鼠为20 mL/kg BW。(b) 小鼠体内抗肿瘤活性测试体内试验用于确定受试物对特定类型肿瘤细胞杀伤或抑制作用,探索受试物产生药效作用给药剂量、路径、频率、周期等。 体内试验通常采取动物肿瘤移植模型和人癌移植模型。 因为动物肿瘤移植模型和临床
15、疗效之间相关性不强,仅可用于侯选化合物初步筛选。通常情况下,以人癌移植模型试验结果来评价抗肿瘤药品有效性。1、 模型建立细胞毒类抗肿瘤药品临床前体内试验通常最少应选择 6 种人癌移植瘤模型,其中应包含 II期临床试验中拟筛选肿瘤组织类型。模型建立和使用应注意: 移植瘤复苏后通常应传 2-3 代后再用于体内抗肿瘤试验;为了保持移植瘤生物学特征和遗传特征,复苏后移植瘤体内传代应少于15-20 代。2、 试验设计肿瘤移植部位关键在皮下,也包含腹腔、肾囊下和原位等。通常待移植肿瘤生长至100-300mm3后将动物随机分组给药。 通常包含高、中、低 3个剂量诊疗组、阳性对照组和阴性对照组。诊疗组受试物剂
16、量选择应能够表现出药品量效关系, 高剂量不宜超出受试物最大耐受剂量。 应依据受试物药动学特点和毒性反应等确定给药频率和周期;给药路径应尽可能和推荐临床用药路径相同。阳性对照药通常应满足以下条件:(1)和受试物作用机制相同或相近;(2)对移植肿瘤敏感;(3)临床广泛应用且疗效确切。阳性对照药给药方案应能够表现出药品最好诊疗作用,其剂量通常不宜超出最大耐受剂量。阴性对照组给对应溶剂。 3、检测指标 推荐使用测量瘤径方法,动态观察受试物抗肿瘤效应。肿瘤直径测量次数依据移植瘤生长情况而定,通常为每七天 2-3次。在试验中还应该观察和药品安全性相关指标,如动物体重增加和死亡率,将诊疗组这些数据和标准诊疗
17、对照组进行比较,对于判定药品安全性和开发前景含相关键意义。 试验中应统计检测指标改变和给药时间关系,方便了解药品作用特点,降低单次统计试验结果可能引发误差。体内抗肿瘤试验结果中还应同时附有对应照片。4、评价标准 对于体内试验结果评价应综合考虑受试物作用机制、模型临床相关性、 每一个模型具体试验结果和受试物和阳性对照药品试验结果比较。 针对每一个人癌移植瘤模型, 推荐采取相对肿瘤增殖率T/C (%)作为试验评价指标,评价标准通常为:T/C(%)40 %为无效;T/C(%) 40%,并经统计学处理 P 0.05 为有效。在体内有效性试验采取全部人癌移植模型中,通常最少应有1/3 达成有效标准,才提
18、醒药品有必需进入临床试验。在评价时还应关注受试物和阳性对照药试验结果比较。在毒性相当(在有效性研究中关键表现为动物体重下降相当)情况下,对受试物诊疗组和阳性对照药组肿瘤增殖率比较也是评价受试物是否有必需进入临床试验指标之一。附:相对肿瘤增殖率T/C(%) :针对每一个人癌移植瘤模型抗肿瘤活性评价指标。计算公式以下:T/C % = TRTV / CRTV*100%。(TRTV:诊疗组RTV ;CRTV:阴性对照组RTV)。 肿瘤体积(tumor volume,TV)计算公式为:V = 1/2ab2 或/6abc。其中a、b、c分别表示长宽高。因为此两公式相关性极好,可采取任一公式。依据测量结果计
19、算出相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV) ,计算公式为: RTV = Vt / V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积,Vt为每一次测量时肿瘤体积。鼠S180移植瘤抑制作用试验1 材料和方法1.1 材料1.1.1 试验用药品1.1.2 动物及瘤株肉瘤S180;试验用昆明小鼠18-22 g。1.1.3 仪器设备灌胃器、手术器械、天平、离心机1.2 方法1.2.1 肿瘤模型建立小鼠S180细胞接种于昆明种小鼠腹腔后,取腹水传代保留。取腹水传代第7日荷瘤小鼠,脱颈椎处死小鼠,消毒腹部皮肤,无菌注射器吸收乳白色腹水,用生理盐水调整肿瘤细胞浓度为1107 /m
20、L,用酒精棉球消毒昆明种小鼠右侧腋下皮肤,于皮下接种上述瘤细胞悬液(0.2 mL/只),常规喂养。1.2.2 药品对小鼠S180抑制作用昆明种小鼠50只,腋下接瘤,次日将荷瘤小鼠随机分为5组,每组10只。分别为模型组、环磷酰胺(CTX)组、药品高、中、低剂量组。干后,称取瘤重,计算抑瘤率:小鼠接瘤后第二日开始按表1所表示剂量和方法给药,CTX组于接瘤后第2日给药,隔天一次,药品组每日给药一次,连续10天,给药体积为0.2 ml/20g体重。末次给药二十四小时后,脱颈椎处死小鼠,剥取瘤组织,去除血污、脂肪等非肿瘤组织,用滤纸吸抑瘤率%=(1给药组平均瘤重/ 对照组平均瘤重)100 %表1 荷瘤小
21、鼠给药剂量和方法组别剂量(mg/kg B.W.)给药方法模型CTX20腹腔注射药品高灌胃中灌胃低灌胃1.2.3 对荷瘤小鼠免疫器官影响动物接种S180瘤株为第0天,第1天开始灌胃,连续灌胃10天 ,第11天处死动物,正确称量动物体重、胸腺重量、脾脏重量,计算胸腺指数和脾脏指数,脏器指数= 脏器重量/体重。表2 药品对免疫指数影响(s)组别剂量(mg/kg B.W.)动物数(n)胸腺指数(110-3)脾指数(110-3)空白对照10CTX20 i.p.10药品1010101.2.4肿瘤组织学观察取部分瘤组织用10中性甲醛固定,石蜡包埋,切片,经苏木精伊红染色,光镜观察。 试验步骤固定液、染色液配
22、置固定液: (1)10%中性福尔马林(pH7.0) 甲醛 100 ml NaH2PO4H2O 4 g Na2HPO4 13 g 蒸馏水 900 ml(2) Harris苏木素: 配方: 苏木素 1 g 无水乙醇 10 ml 蒸馏水 200 ml 钾明矾 20 g HgO 0.5 g 先将苏木素溶于无水乙醇中,备用。把明矾放入蒸馏水,加热溶解,再加入备用苏木素,煮沸 2 分钟,先加入少许氧化汞,预防氧化过程中苏木素外溢,玻棒搅拌,然后,边搅拌边加入氧化汞。加完后,立即移至冰水中,加速其冷却,静置一夜后,过滤。用前以 5% 百分比加入冰醋酸。 (3)伊红(醇溶性) 配方: 伊红 (醇溶性) 2.5
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