几丁质对海洋生防酵母抑菌活性的影响及相关机理的研究本科学位论文.doc
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1、哈尔滨工业大学学士学位论文工学学士毕业论文几丁质对海洋生防酵母(Rhodosporidium paludigenum)抑菌活性的影响及相关机理的研究A Thesis for the Degree of B. Eng Impact and Mechanism of Chitin on the Marine Yeasts Antibacterial ActivityCandidate:Laifeng LuSupervisor:Guangfeng KanAcademic Degree Applied for:Bachelor of EngineeringSpecialty:Food Science
2、and EngineeringDate of Oral Examination:June, 2010University:Harbin Institute of Technology哈尔滨工业大学学士学位论文 摘要毕业设计(论文)原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺:所呈交的毕业设计(论文),是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知,除文中特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果,也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体,均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作 者 签
3、 名: 日 期: 指导教师签名: 日期: 使用授权说明本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计(论文)的规定,即:按照学校要求提交毕业设计(论文)的印刷本和电子版本;学校有权保存毕业设计(论文)的印刷本和电子版,并提供目录检索与阅览服务;学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文;在不以赢利为目的前提下,学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名: 日 期: 学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,
4、均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名: 日期: 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名:日期: 年 月 日导师签名: 日期: 年 月 日摘 要生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质,通过喷洒或浸渍果实处理,以降低或防治果实采后病害的保鲜方法。本实验通过利用酵母细胞壁组分
5、之一几丁质诱导培养本实验室分离得到的拮抗菌株海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman(经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心CABI Bioscience Identification Services鉴定为Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman)以提高其采后果实病害生物防治效果。结果如下:(1)体内试验结果表明,几丁质诱导后,R. paludigenum的果实采后青霉病害生物防治效果得到显著提高。(2)几丁质诱导提高R. paludigenum生防效力的最佳诱导浓度为1.0%(w/v),最佳诱导培养时
6、间为3648 h。此外,试验结果表明,几丁质诱导培养与NaCl诱导培养之间并不存在协同增效作用。(3)机理实验结果表明,几丁质诱导培养后,R. paludigenum在苹果、梨果实伤口处的生长速度显著提高,菌体数量显著增加。(4)几丁质诱导培养后,R. paludigenum的发酵上清液对苹果果实伤口处扩展青霉的侵染有一定抑制作用。而未经诱导R. paludigenum 的发酵上清液对苹果果实伤口处扩展青霉的侵染没有抑制作用,反而有促进效果。(5)果实诱导抗性试验结果表明,R. paludigenum能激发苹果果实对青霉病害的抗性,而经NYCB诱导培养的酵母能进一步增强这种对果实抗性的诱导作用
7、。其机理可能与激发苹果果实伤口处组织的POD酶活性有关。综上所述,几丁质诱导可以提高R. paludigenum的产后果实生物防治效果,其机理可能与诱导培养后,能促进R. paludigenum在果实伤口处的生长、刺激酵母分泌抑菌物质和增强酵母对果实抗性的诱导有关。关键词: Rhodosporidium paludigenum;几丁质;诱导;生物防治III 哈尔滨工业大学学士学位论文 外文摘要ABSTRACTBiological control is a method that using microbial strains or antibiotic substances, by spray
8、ing or dipping, to decrease postharvest decay of fruits. We planned to use chitin (one of the yeast cell wall components) to co-culture with Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman isolated by our laboratory Colleague in marine yeast (Identified by CABI Bioscience Identification Services as Rhodos
9、poridium paludigenum Fell & Tallman) to enhance the effectiveness of its biological control of postharvest decays of fruits. (1) In vivo test results showed that R. paludigenum induced by chitin can increase its biological control of postharvest diseases (BCPD) effect significantly. (2) The optimal
10、concentration for induction was 1.0% (w/v), the optimal time for induction was 3648 hours. There was no collaborative effect between chitin and NaCl on the BCPD of R. paludigenum.(3) Data showed population and growth speed of R. paludigenum in wounds of apple and pear increased significantly.(4) Dat
11、a showed that R. paludigenum cultured in medium with chitin had inhibitory effect to the decay of pears caused by Penicillium expansum, R. paludigenum cultured in NYDB has no inhibitory, but a promoting effect. (5) Through the induction of fruit resistance and associated biological control results s
12、howing that R. paludigenum could stimulate the resistance of fruits against the external infection. Meanwhile, chitin could improve their ability to inhibit the decay incidence and fruit resistance. The ability to stimulate fruits POD activity may be related.In conclusion, R. paludigenum induced by
13、chitin could increase its BCPD effect. The promoting of R. paludigenums growth in fruit wounds, secreting of antimicrobial substances and induced resistance of fruit after being induced may be the mechanism.Key words: R. paludigenum; Chitin; Induction; BCPD哈尔滨工业大学学士学位论文 目录目 录摘 要ABSTRACT第一章 文献综述11.1
14、我国水果产业发展概述11.2 果蔬采后病害的侵染研究1 1.2.1 采后病原真菌的侵染方式1 1.2.2 采后病原真菌的致病机理21.3 果蔬采后病害的控制方法2 1.3.1 化学杀菌剂的使用3 1.3.2果实采后病害防治物理方法3 1.3.3果实采后病害生物防治41.4 采后拮抗酵母作用机制4 1.4.1营养和空间的竞争4 1.4.2重寄生作用5 1.4.3胞外活性物质的产生5 1.4.4诱导抗性6 1.4.5抗生作用61.5 拮抗菌生理调控及机理的研究7 1.5.1逆境培养7 1.5.2拮抗物质的分泌和积累8 1.5.3 基因工程技术的应用81.6 本课题研究目的81.7 应用前景和学术价
15、值9第二章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制效果研究102.1 前言102.2 实验材料和方法10 2.2.1 主要仪器10 2.2.2拮抗菌及其培养11 2.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备11 2.2.4 试剂11 2.2.5 果实选择与预处理12 2.2.6 几丁质对R. paludigenum生防效果的影响12 2.2.7 数据处理分析与作图132.3 结果13 2.3.1 不同浓度几丁质对R. paludigenum生防效力的影响13 2.3.2几丁质诱导后不同浓度R. paludigenum酵母的生防效果15 2.3.3 不同培养时间对几丁质诱导下R.
16、 paludigenum生防效力的影响17 2.3.4 几丁质与NaCl结合诱导对R. paludigenum生防效力的影响182.4 讨论20第三章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制机理研究223.1 前言223.2 实验材料和方法22 3.2.1 主要仪器22 3.2.2拮抗菌及其培养23 3.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备23 3.2.4 果实选择与预处理23 3.2.5 几丁质对R. paludigenum生防机理的影响23 3.2.6 数据处理分析与作图243.3 结果24 3.3.1几丁质对R. paludigenum在果实伤口处生长动态的影响24
17、3.3.2几丁质处理后R. paludigenum对果实诱导抗性的影响26 3.3.3几丁质处理后R. paludigenum发酵上清液的抑菌效果27 3.3.4 几丁质培养后R. paludigenum对果实POD酶活性的影响273.4 讨论28第四章 结果与展望304.1 本论文的主要研究结果304.2 本实验的后续研究及展望30致谢32参考文献33附 录372哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述第一章 文献综述1.1 我国水果产业发展概述水果是维生素、矿物质和膳食纤维的重要来源,是人们维持身体健康,增进营养必不可少的主要食品,是世界上仅次于粮食的农产品。中国是世界水果生产大国,总
18、收获面积和产量以及多种水果的产量均居世界首位。蔬菜、水果产业是我国国内仅次于粮食产业的第二、第三大产业。2007年3月国家统计局发布的中华人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报显示,2006年我国水果总产量为17050万吨。据2010年初步统计,2009全国水果面积约1.6亿亩,与上年基本持平,产量1.2亿吨,同比增9。根据联合国粮食组织对50多个国家的调查,发展中国家水果收获后的平均损失率在30%以上。我国水果因采后处理技术落后,作为产量第一大国,水果腐烂损失也高居全球榜首。根据一般保守的估计,我国水果采后损失为20%30左右。据此估算,我国每年水果采后的经济损失将达到数百亿元人民币
19、的水平。 导致果实采后损失的因素很多,主要包括:(1)由于采前栽培管理、采收和采后处理技术不当而造成的损失;(2)由于果实采后水分和营养消耗造成的失重和枯萎等品质劣变而引起的损失;(3)由于采后逆境造成的果实生理代谢失调而引起的损失;(4)由于采后成熟衰老造成果实组织结构崩溃而引起的损失;(5)由于病原物侵染造成的腐烂损失等。 由各种病原物引起的植物病害每年都给各国经济造成重大的损失,其中又以真菌性病害最为严重。据估计,仅美国每年由真菌性病害造成的经济损失就达330亿美元(Maor和Shirasu, 2005;Strange和Scott, 2005)。真菌也是引起采后果实病害的主要病原物(Sh
20、olberg和Conway,2004)。病原真菌不仅会造成果实数量上的巨大损失,而且许多病原真菌分泌产生的大量次生代谢产物还可能会引起严重的食品安全问题,如曲霉菌(主要是Aspergillums flavus和Aspergillums parasiticus等)产生的黄曲霉毒素、扩展青霉(Penicillium expansum)产生的棒曲霉素(patulin)等(Martins et al., 2002;Sholberg和Conway, 2004;Dombrink-Kurtzman和Blackburn, 2005;Brodhagen和Keller,2006;Morales et al., 2
21、007)。1.2 果蔬采后病害的侵染研究由真菌病害引起的果实采后的腐烂变质是导致水果大量损失的主要原因之一。病原真菌不仅会造成果实数量上的巨大损失,而且许多病原真菌分泌产生的大量次生代谢产物还可能引起严重的食品安全问题。1.2.1 采后病原真菌的侵染方式采后病原真菌主要通过3种途径或方式入侵果实:(1)通过机械伤或虫害等造成的伤口;(2)通过自然开放的皮孔、气孔、果实和花梗结合部位;(3)通过分泌寄主细胞壁水解酶等直接突破果实表皮的防御机制(Prusky和Lichter, 2007)。病原菌孢子一旦接触伤口组织,侵染就开始了(Janisiewicz和Korsten, 2002;Prusky和L
22、ichter, 2007)。而在没有伤口等便利的入侵途径的情况下,许多采后病原真菌的孢子可能会长时间潜伏在果实表面,直到果实成熟和衰老后才发起对果实的攻击(Prusky和Lichter, 2007)。1.2.2 采后病原真菌的致病机理采后病原真菌具有众多而且复杂的致病机理,但其最终目的都是成功的侵染寄主。病原真菌分泌产生的寄主细胞壁分解酶是研究较多、机理较为明确的重要致病因子,其主要包括多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、果胶裂解酶(pectatelyase)、木聚糖酶(xylanases)、木糖苷酶(xylosidase)、蛋白酶(protease)、葡聚糖酶(gluca
23、nases)、漆酶(laccase)等(Snchez-Torres和Gonzlez-Candelas,2003;Akimitsu et al., 2004)。这些酶可能涉及病原真菌多方面的侵染机制和过程,如渗透、组织泡软、营养获得、改变寄主生理等(Snchez-Torres和Gonzlez-Candelas, 1996;Akimitsu et al., 2004)。1.2.2.1致病菌酸化果实组织P. expansum、P. digitatm 和P. italicum 等酸性病原真菌能产生柠檬酸和葡萄糖酸等有机酸,使寄主果实组织发生酸化,进而促进病原菌致病因子,如PG基因(pepgl)的表达(
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