lncRNA_MEG8通过...促进非小细胞肺癌的肿瘤进展_林燕明.pdf
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1、基金项目:湛江市科技计划项目(2022B01089)作者简介:林燕明,男,1986 09 生,硕士,主治医师,E-mail:mlzsac163 com收稿日期:2022 10 11lncNA MEG8 通过调控 mi-363-3p/PAX6 轴促进非小细胞肺癌的肿瘤进展林燕明,陈玉婷,林慕文,李姝君,王永存*(广东医科大学附属医院肺部肿瘤专科,湛江524000;*通讯作者,E-mail:wycdiyi163 com)摘要:目的探讨长非编码 NA 母系表达基因8(lncNA MEG8)通过调控 mi-363-3p/人类配对盒基因6(PAX6)轴促进非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤进展。方法选取
2、116 例经确诊为 NSCLC 患者的肿瘤组织与癌旁正常组织标本,常规培养人NSCLC 细胞株 A549、H1299,采用 T-qPC 法检测组织和细胞中 lncNA MEG8、mi-363-3p 和 PAX6 mNA 的表达。将A549、H1299 细胞分别分为对照组(control 组,空白培养基处理)、pcDNA 组(转染 pcDNA)、pcDNA-MEG8 组(转染 pcDNA-MEG8)、pcDNA-MEG8+mi-NC 组(pcDNA-MEG8 与 mi-NC 共转染)、pcDNA-MEG8+mi-363-3p mimic 组(pcDNA-MEG8 与mi-363-3p mimic
3、 共转染)。CCK-8 法检测培养 24,48,72 h 各组细胞增殖能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡;采用 Western blot 检测凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 PAX6 蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验分别验证 MEG8 和 mi-363-3p、mi-363-3p 和 PAX6 的关系。NA 结合蛋白免疫沉淀(IP)实验检测 lncNA MEG8、mi-363-3p和 PAX6 之间的结合。结果与正常组织相比,肿瘤组织中 lncNA MEG8、PAX6 mNA 高表达,mi-363-3p 呈现低表达(均 P0 05)。与 con
4、trol 组和 pcDNA 组相比,pcDNA-MEG8 组培养 48,72 h A549 和 H1299 细胞增殖能力、细胞迁移率、PAX6、Bcl-2 蛋白表达显著升高(P 0 05),细胞凋亡率和 Bax、Caspase-3 蛋白显著降低(P 0 05)。与 pcDNA-MEG8 组和pcDNA-MEG8+mi-NC 组相比,pcDNA-MEG8+mi-363-3 mimic 组培养 48,72 h A549 和 H1299 细胞增殖能力、细胞迁移率、PAX6、Bcl-2 蛋白表达显著降低(P0 05),mi-363-3p 表达、细胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表达显著升高(
5、P 0 05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,与 mi-NC+MEG8-WT 共转染组相比,mi-363-3p mimic+MEG8-WT 共转染组荧光素酶活性显著降低(P0 05);与 mi-NC+MEG8-MUT 共转染组相比,mi-363-3p mimic+MEG8-MUT 共转染组荧光素酶活性无显著差异(P0 05)。与 mi-NC+PAX6-WT 共转染组相比,mi-363-3p mimic+PAX6-WT 共转染组荧光素酶活性显著降低(P 0 05);与 mi-NC+PAX6-MUT 共转染组相比,mi-363-3p mimic+PAX6-MUT 共转染组荧光素酶活性无显著性差异
6、(P 0 05)。IP 实验结果显示,与 IgG 处相比,lncNA MEG8 和 mi-363-3p、mi-363-3p 和 PAX6 均主要富集在 Ago2 处,IgG 处与Ago2 处的 lncNA MEG8、mi-363-3p 和 PAX6NA 相对表达水平均具有统计学差异(P 0 05),提示 lncNA MEG8 和 mi-363-3p、mi-363-3p 和 PAX6 能靶向结合。结论过表达 lncNA MEG8 可能通过下调 mi-363-3p 并促进 PAX6 蛋白的表达,进而促进 NSCLC 的进展。关键词:母系表达基因 8;mi-363-3p/人类配对盒基因 6;非小细胞
7、肺癌;细胞凋亡;细胞增殖;细胞迁移中图分类号:734 2文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0416 09DOI:1013753/j issn1007 6611202304002LncNA MEG8 promotes tumor progression in non-small cell lung cancer by regulating mi-363-3p/PAX6 axisLIN Yanming,CHEN Yuting,LIN Muwen,LI Shujun,WANG Yongcun*(Department of Lung Cancer,Affiliated Hos
8、pital of Guang-dong Medical University,Zhanjiang 524000,China;*Corresponding author,E-mail:wycdiyi163 com)Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of long non-coding NA maternally expressed gene 8(lncNA MEG8)on tumor pro-gression of non-small cell lung cancer(NSCLC)by regulating the mi-363-3p/hum
9、an paired box gene 6(PAX6)axisMethodsTumor tissue and adjacent normal tissue specimens from 116 patients diagnosed with NSCLC were collected,and human NSCLC celllines A549 and H1299 were routinely cultured,and then T-qPC was used to detect the expression of lncNA MEG8,mi-363-3pand PAX6 mNA in tissue
10、s and cells A549 and H1299 cells were divided into control group(blank medium treatment),pcDNA group(transfected with pcDNA),pcDNA-MEG8 group(transfected with pcDNA-MEG8),pcDNA-MEG8+mi-NC group(co-transfectedwith pcDNA-MEG8 and mi-NC),and pcDNA-MEG8+mi-363-3p mimic group(co-transfected with pcDNA-ME
11、G8 and mi-363-3pmimic)CCK-8 method was applied to detect the cell proliferation ability at 24,48,72 h;cell scratch assay was applied to detect thecell migration ability;flow cytometry was applied to detect the apoptosis;Western blot was applied to detect the expression of apoptosis-related proteins
12、Bax,Bcl-2,Caspase-3 and PAX6 Dual-luciferase reporter assays were applied to verify the relationship betweenlncNA MEG8 and mi-363-3p,mi-363-3p and PAX6,respectively NA binding protein immunoprecipitation(IP)assay wasused to detect the binding between lncNA MEG8,mi-363-3p and PAX6esultsCompared with
13、normal tissues,lncNA MEG8614J Shanxi Med Univ,Apr 2023,Vol 54 No 4and PAX6 mNA expression levels were increased in tumor tissues,and mi-363-3p expression was decreased(P0 05)Comparedwith control group and pcDNA group,the cell proliferation ability at 48 h and 72 h,the cell migration rate,and the pro
14、tein expressionof PAX6,Bcl-2 in A549 and H1299 cells were significantly increased in pcDNA-MEG8 group(P 0 05),while the apoptosis rate,and Bax and Caspase-3 protein levels were significantly decreased(P0 05)Compared with pcDNA-MEG8 group and pcDNA-MEG8+mi-NC group,the proliferative capacity at 48 h
15、and 72 h,the cell migration rate,PAX6 and Bcl-2 protein expression levels inA549 and H1299 cells were significantly decreased in pcDNA-MEG8+mi-363-3 mimic group(P 0 05),while the expression ofmi-363-3p,the apoptosis rate,Bax and Caspase-3 protein expression levels were significantly increased(P 0 05
16、)The results ofdouble luciferase reporter gene experiment showed that the luciferase activity in mi-363-3p mimic+MEG8-WT co-transfection groupwas significantly lower than that in mi-NC+MEG8-WT co-transfection group(P 0 05)Compared with mi-NC+MEG8-MUT co-transfection group,the luciferase activity had
17、 no significant difference in mi-363-3p mimic+MEG8-MUT co-transfection group(P 005)Compared with mi-NC+PAX6-WT co-transfection group,the luciferase activity in mi-363-3p mimic+PAX6-WT co-transfectiongroup was significantly decreased(P 0 05);compared with mi-NC+PAX6-MUT co-transfection group,the luci
18、ferase activity inmi-363-3p mimic+PAX6-MUT co-transfection group had no significant difference(P0 05)The results of IP experiment showedthat compared with IgG,lncNA MEG8 and mi-363-3p,mi-363-3p and PAX6 were mainly enriched at Ago2,and the relativeexpression levels of lncNA MEG8,mi-363-3p and PAX6 w
19、ere significantly different at Ago2 and IgG(P 0 05),indicating thatthere was target relationships between lncNA MEG8 and mi-363-3p,mi-363-3p and PAX6ConclusionOverexpression oflncNA MEG8 may promote the progression of NSCLC by down-regulating mi-363-3p and promoting the expression of PAX6 proteinKey
20、 words:maternally expressed gene 8;mi-363-3p/human paired box gene 6;non-small cell lung cancer;cell apoptosis;cell proliferation;cell migration非 小 细 胞 肺 癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中的常见肿瘤类型,占肺癌患者的85%1。NSCLC 的早期临床症状不明显,患者较难察觉,确诊时多为中晚期,严重影响了肿瘤治疗效果和患者的生命健康2。lncNA 是一种长度超过200 nt,但蛋白质编码能力缺失的 NA
21、 分子,其能作为癌基因或者抑癌基因,与肿瘤细胞增殖、生长、凋亡、代谢密切相关,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用3。lncNA MEG8 作为一种 lncNA,在多种肿瘤细胞或组织中异常表达,如结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌等4,5。研究发现,NSCLC 患者中 lncNA MEG8表达水平提高6,但其与 mi-363-3p/PAX6 轴的具体关系尚未明确。mi-363-3p 作为一种微小 NA,在多种恶性肿瘤如胆囊癌、胃癌和胶质瘤等中参与了肿瘤细胞的分化和存活等生物学过程7,8。PAX6是胚胎形成期的重要转录因子,在胰腺癌、胃癌中呈现高表达,提示其可能参与了肿瘤的形成9。但lncNA MEG8 能否通
22、过调控 mi-363-3p/PAX6 轴促进 NSCLC 的肿瘤进展,目前尚未明确。本研究以NSCLC 患者癌组织及 NSCLC 细胞株 A549 和 H1299细胞 为 研 究 对 象,探 讨 lncNA MEG8 基 因 对NSCLC 肿瘤进展的影响及其具体机制。1材料与方法1 1资料本研究共收集 2020 年 1 月至 2022 年 1 月在本院确诊为 NSCLC 的 116 例患者的肿瘤组织及癌旁正常组织样本作为研究对象。且入选患者在术前未接受过任何形式的放疗、化疗等抗肿瘤靶向治疗。1 2实验细胞与主要试剂人 NSCLC 细胞株 A549、H1299,均购自中国科学院上海细胞库。胎牛血
23、清、PMI1640 培养基(含青霉素与链霉素)、胰蛋白酶、PBS、Trizol 试剂购自Sigma 公司(美国);CCK-8 试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司;BCA 蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;mi-NC、mi-363-3p mimic、pcDNA31、pcDNA3 1-MEG8 购自美国 Thermo Fisher公司;IPA 裂解液购自德国 Merck 公司;Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 PAX6 一抗及其相应二抗购自英国Abcam公司;细胞凋亡试剂盒购自上海联科生物科技有限公司;NA 结合蛋白免疫沉淀(NA immu-noprecipitation,IP
24、)试剂盒购自上海创赛科技有限公司。1 3细胞培养将 A549、H1299 细胞培养在含10%胎牛血清的PMI1640 培养基中,在 37、5%CO2的细胞培养箱环境中培养。每 2 d 更换一次新鲜培养基,待细胞融合至 80%左右进行传代,传代 3 次后取对数生长期细胞用于实验。1 4细胞分组与转染将处于对数生长期的 A549、H1299 细胞分别分为对照组(control 组)、pcDNA 组(转染 pcDNA3 1)、714山西医科大学学报,2023 年 4 月,第 54 卷 第 4 期pcDNA-MEG8 组(转染 pcDNA3 1-MEG8)、pcDNA-MEG8+mi-NC 组(pcD
25、NA3 1-MEG8 和 mi-NC 共转染)、pcDNA-MEG8+mi-363-3p mimic 组(pc-DNA3 1-MEG8 和 mi-363-3p mimic 共转染)。按上述对各组细胞进行转染或处理,转染 24 h 后用于后续实验。1 5T-qPC 法检测 NSCLC 患者肿瘤组织中lncNA MEG8、mi-363-3p 和 PAX6 mNA 的表达取相应标本加入 Trizol 试剂提取组织总 NA,将 NA 反转录为 cDNA。以 GAPDH、U6 为内参进行 PC 扩增反应。引物序列设计如下:lncNAMEG8 上游引物 5 ATCTCCAGCCTTGACTCTGA-CAC
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