基于PI3K_AKT_GSK3β信号通路探讨“还神至圣汤”对AD大鼠学习记忆的影响.pdf
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1、61duGExploreT/药理毒理56PharmacyChineseMateriaMedica2023;14(5)anaYC中药与临床基于PI3K/AKT/GSK3信号通路探讨“还神至圣汤”对AD大鼠学习记忆的影响刘洁,潘嘉,张力涵?摘要】目的:A25-35淀粉酶注射SD大鼠建立老年痴呆大鼠(AD)模型,评价还神至圣汤对AD大鼠学习记忆能力的影响。方法:50 只SD大鼠随机分为正常对照组,模型组、实验药物10.2、2 0.4、40.8 g.kg剂量组,10 只/组。除正常对照组外,其余各组大鼠海马区注射A25-35淀粉酶建立AD模型。建模后第2 天各组动物每日给药,连续30 天,正常对照组、
2、模型组给予等体积生理盐水,末次给药后2 4h,剖取大鼠右侧海马组织,采用WB法测定海马区PI3K、A K T、P-AKT、G SK 3、P-G SK 3蛋白水平。模型建立后14天,开展Morris水迷宫实验测定AD大鼠学习记忆能力。结果:还神至圣汤各剂量组明显减少平台逃避潜伏期,提高穿越平台次数和目标象限停留时间百分比(P0.05)。还神至圣汤2 0.4、40.8g.kg剂量组PI3K、p-A k t、p-G SK 3蛋白含量有明显增加(P0.05,40.8 g.k g 剂量组p-GSK3除外)。P-Akt/Akt、P-GSK3/GSK3比值也明显增加(P0.05)。结论:还神至圣汤可改善由A
3、25-35淀粉样蛋白诱导的AD模型大鼠的学习记忆能力,其作用可能通过调控PI3K/AKT/GSK3通过信号通路实现的。关键词 还神至圣汤;海马组织;PI3K/AKT/GSK3信号通路中图分类号 R285.5文献标识码 A文章编号 16 7 4-9 2 6 X(2023)05-011-04the effect of Huanshen zhisheng Decoction on learning anzhisheng Decoction on learning and memory ability of Alarning and memory ability of AD rats based on
4、 PI3K/AKSK3 signaling pathway/LIU Jie,PAN Jid,ZHANG Li-han/(I.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences,Cheng(0000,Sichuan;2.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,Sichuan)Abstract)Objective:The rat model of senile dementia(AD)was established by injecting A25-35 amylase
5、 in order toexplore the effects of Huanshenzhisheng Decoction(HSZS)on the learning and memory ability of AD rats.Method:Fifty healthrats were randomly divided into five groups as the control group(NS),the model group,three dosages of HSZS groups(10.2g.kg,20.4 g.kg,40.8 g.kg),ten rats in each group.A
6、D model was established by injecting A25-35 amylase into hippocampusof rats in each group,except control group.In the 2nd day,rats in the control and model groups were treated with saline,whilerats in HSZS groups were orally treated with different doses of HSZS for thirty days,Morris water maze test
7、 was conducted todetermine the learning and memory ability of AD rats in 14th days after the model establishment.Twenty-four hours after the lastadministration,the right hippocampal tissue of rats was dissected,and the protein levels of PI3K,AKT,p-Akt,GSK3 and p-GSK3in the hippocampus were detected
8、by WB method.Result:The platform escape latency of rats in the model control group wasdecreased,and the times of crossing the platform and the percentage of target quadrant residence time were significantly increasedin each group of HSZS(p0.05).The level of PI3K,p-Akt,p-GSK3 was increased in group o
9、f middle dosage,as the same asPI3K,p-Akt in high dosage.The ratio of P-Akt/Akt and P-GSK3/GSK3 were significantly increased(P0.05).Conclusion:HSZS Decoction can improve the learning and memory ability of AD rats induced by A25-35 amyloid protein,which may beachieved by regulating PI3K/AKT/GSK3 signa
10、ling pathway.Key words Huanshengzhishen Decoction;hippocampus;PI3K/AKT/GSK3 signal pathway阿尔茨海默病(AD)在中医学属于“呆病”基金项目 四川省科技厅应用基础项目(2 0 2 1JDKY0013)作者单位】1.四川省中医药科学院,四川成都6 10 0 0 0;2.成都中医药大学,四川成都6 11137作者简介刘洁(19 7 9-),女,副研究员,主要从事中药药理学与毒理学研究Email:通讯作者 潘嘉(19 7 0-),女,副研究员,主要从事中药药理与临床研究Email:收稿日期 2 0 2 3-0 3
11、-2 9“健忘”、“癫病”等范畴,主要病机特点是由于年迈体虚,久病不复等导致五脏精气虚衰,痰瘀阻痹,渐使脑髓亏虚,脑髓失养,神机失用所致。其病位在脑,归于心,与五脏功能失调密切相关。根据中医虚者补之,实则泻之的原则,补益虚损,解郁散结为治则。还神至圣汤出自辨证录卷四,处方记载为,人参一两,白术一两,茯神5钱、生枣5钱,广木香3钱、制天南星3钱、荆芥3钱,甘草1钱、良姜1钱、附子1钱、积壳1钱,蒲5分。主治57Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(5)中药与临床呆病,具有开郁逐痰,健胃通气之功效。本研究采用大鼠海马区注射A2
12、5-35淀粉酶建立AD模型,研究还神至圣汤对AD大鼠学习记忆能力的影响、探讨其可能的作用机制,为临床上本方剂用于治疗AD患者提供可靠的理论依据及实验基础。1材料1.1实验药物根据中国科学技术史度量衡卷考证的明清时期一两约36.8 g,一钱约3.6 8 g,一分约0.37 g折算,参考中华人民共和国药典(2 0 2 0 版)第一部推荐处方的用法用量并结合临床医师用药经验,将还神至圣汤处方调整如下:人参5g,白术2 0 g,茯神2 0 g、生枣2 0 g,广木香3g、制天南星3g、荆芥9g,甘草3g、良姜3g、附子3g、积壳3g,菖蒲10g。处方共计药材10 2 g为成人一天用量。依据陈奇主编中药
13、药理研究方法学(1993年)第1版附录二“实验动物与人用药量换算”,以及黄继汉发表的药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算,设定本实验研究药物低、中、高剂量分别为10.2、2 0.4、40.8 gkg,相当于临床剂量6倍,12 倍,2 4倍。上述药材均为免煎颗粒,购于成都中医药大学附属医院,生产商:四川新绿色药业科技发展有限公司。1.2动物SD大鼠,50 只,雄性3,18 0-2 0 0 g,购自四川省中医药科学院。动物生产许可证号SCXK(川)2 0 18-19,实验动物使用许可证SYXK(川)2 0 18-10 0。所有大鼠饲养于符合SPF的环境中(温度2 0+2 C、湿度50%-7
14、 0%、昼夜各12 h)。本研究经四川省中医药科学院动物中心伦理委员会批准,决议编号SYLL(2022)-054,实验设计及实施过程中严格遵循动物实验3R原则。1.3试剂AKT,P-AKT,GSK3,PI3K(abcam,ab179463,a b 192 6 2 3,a b 2 8 0 37 6,a b 1916 0 6)。P-GSK3(ser9)(CST,5558 T)。BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo,PICPI2 32 2 3)。A 25-35淀粉酶(Sigma,0 0 0 0 1136 56)-2 0 避光保存,使用前溶解在0.9%的无菌的生理盐水,配成浓度2.0 g.L,37 孵
15、育1周,使其成聚集态,然后置于-2 0 冰箱保存备用。戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司,WS20051129)。1.4仪器68000系列大鼠脑定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);7 8 0 0 1微型手持钻(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);Morris水迷宫及视频分析系统(成都泰盟公司,WMT-100);电泳仪(美国BIORAD,m i n i p r o t e a n 3c e l l)。电转仪(美国HOEFER,TE77XP);酶标仪(美国PE,Vi c t o r Ni v o);成像系统(上海天能科技有限公司,Tanon-5200)。2方法与结果2.1动物分组建模与给药50只
16、SD大鼠按体重随机分成5组,每组10 只,设正常对照A组、模型对照B组、实验药物低剂量10.2g.kg(C组)、中剂量2 0.4g.kg(D 组)、高剂量40.8 g.kgl(E组)。动物适应性喂养1周,除正常对照A组外,其余各组动物按如下操作建立老年痴呆AD大鼠模型。各组动物腹腔注射6 0 mg.kg戊巴比妥钠麻醉,将麻醉大鼠固定于脑立体定位仪,剪开头部皮肤,暴露头骨。于前卤后3.5mm,中线旁开2 mm,硬脑膜下2.9mm定位双侧海马,并用颅骨钻钻孔。除假手术组外,采用微量注射泵于5min内缓慢注射5L(10 g)老化1周的A25-35淀粉样蛋白溶液于大鼠右侧大脑海马组织,假手术组注射等量
17、无菌生理盐水。采用齿科水门汀封闭颅骨,缝合皮肤。每日连续腹腔注射青霉素钠10 万U.只,连续3日,防止感染。模型建立后14天,实验动物进行Morris水迷宫实验。模型建立第2 天,各组动物常规灌胃给药,每日按照10 0 g.mL常规灌胃给予大鼠,连续给药30 天,正常对照组、模型组给予等体积生理盐水。每周对实验大鼠称重1次,并根据体重调整给药体积。给药结束后2 4h,大鼠用戊巴比妥钠麻醉腹股沟放血处死,并剖取大鼠大脑的左右侧海马组织,并置于-8 0 冰箱保存备用。2.2Morris水迷宫实验Morris水迷宫实验分为前5d的定位航行实验和第6 d的空间探索实验。将水迷宫圆形水池分为四个象限,逃
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