恶臭假单胞菌HB3S-20在棉花中的定殖及诱导抗性研究.pdf
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1、40(1)117-125 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 2 月 收稿日期:2023-07-11 基金项目:湖北省农业科技创新中心项目(2021-620-000-001-011);农业部华中作物有害生物综合治理重点实验室开放基金(2021ZTSJJ2)作者简介:金利容,副研究员,E-mail:jinlirong_;*通信作者:研究员,E-mail:。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.069 恶臭假单胞菌HB3S-20在棉花中的定殖及诱导抗性研究 金利容,许 冬,王 玲,丛胜波,李文静,
2、杨妮娜,尹海辰,黄 薇,万 鹏*(农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室/湖北省农业科学院植保土肥研究所,武汉 430064)摘要:植物内生菌是防治植物病害的重要生防资源。恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida HB3S-20 是本实验室从棉花内生细菌中所筛选到的一株对棉花黄萎病具有显著防效的潜在生防菌株。本研究采用利福平抗性标记技术和绿色荧光蛋白(GFP)标记技术检测了菌株 HB3S-20 在棉花组织中的定殖动态和定殖位点,并检测了菌株 HB3S-20 接种棉花植株后植物防御相关酶 SOD、POD 和 CAT 酶活性的变化。利福平标记
3、试验结果表明,菌株 HB3S-20 主要定殖于根部,棉株接种菌株 HB3S-20 后第 330 d 检测到棉花根部内的菌量范围为 2.21046.7104 cfu/g,检测到棉花茎部内的菌量为 0.041042.7104 cfu/g,棉花茎部内的菌量低于根部,但在叶片中未被分离到。GFP 标记试验结果表明,菌株 HB3S-20 不仅能附着在棉花根系表面,还能定殖在根部维管组织中。此外,菌株 HB3S-20 能够提高棉花中植物防御相关酶 SOD 和 POD 的活性,说明菌株 HB3S-20 能够诱导棉花植株的系统抗性,增强棉花抗病性。本研究初步揭示了恶臭假单胞菌HB3S-20 在棉花组织内的定殖
4、规律及其对棉株产生的诱导抗性,为菌株 HB3S-20 的防病机制研究提供了理论依据。关 键 词:恶臭假单胞菌;棉花;定殖;诱导抗性 中图分类号:S476 文献标识码:A 文章编号:1005-9261(2024)01-0117-09 The Colonization and Induced Resistance of Pseudomonas putida HB3S-20 in Cotton JIN Lirong,XU Dong,WANG Ling,CONG Shengbo,LI Wenjing,YANG Nina,YIN Haichen,HUANG Wei,WAN Peng*(Key Labor
5、atory of Integrated Pest Management on Crops in Central China,Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei Key Laboratory of Crop Disease,Insect Pests and Weeds Control/Plant Protection,Soil and Fertilizer Research Institute,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)Abstract:Endop
6、hytes are important biocontrol resources in controlling plant diseases.The Pseudomonas putida HB3S-20 was screened as a potential biocontrol agent which had significant control effect against cotton Verticillum wilt in our laboratory.The colonization dynamics and colonization sites of strain HB3S-20
7、 in cotton tissues were detected using rifampicin resistance labeling technique and GFP labeling technique in this study.Moreover,the activities of the plant defense-related enzymes SOD,POD and CAT of cotton after inoculation of the strain HB3S-20 were detected.The rifampicin resistance labeling exp
8、eriment showed that the strain HB3S-20 mainly colonized the roots of cotton,the amount of bacteria of the strain HB3S-20 detected in cotton roots ranged from 2.2104 to 6.7104 cfu/g on the 3rd to 30th day after inoculation of the strain HB3S-20.The amount of bacteria of the strain HB3S-20 detected in
9、 cotton stems ranged from 0.04104 to 2.7104 cfu/g,lower than the amount of bacteria in roots,but not found in leaves.The results of GFP labeling experiment showed that the strain HB3S-20 not only attached to the surface of cotton roots but also colonized the vascular system of cotton roots.Moreover,
10、the strain HB3S-20 could increase the activities of the plant defense-related enzymes SOD and POD in cotton,and it 118 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 indicated that the strain HB3S-20 could induce systemic resistance and enhance the resistance of cotton to the pathogens.In this research,the colonization reg
11、ulation and induced resistance of Pseudomonas putida HB3S-20 in cotton were studied,which provides theoretical basis for the mechanism of the strain HB3S-20 controlling cotton Verticillium wilt.Key words:Pseudomonas putida;cotton;colonization;induced resistance 棉花黄萎病是由大丽轮枝菌 Verticillium dahliae(Vd)引
12、起的一种土传维管束病害,能够给棉花造成严重的经济损失。大丽轮枝菌的寄主范围广,其中包括一些重要的经济作物如棉花、马铃薯、茄子、番茄、黄瓜等。大丽轮枝菌能够产生抗逆性强的微菌核,微菌核可在土壤中存留数年或十几年1,给病害防治增加了难度。棉花黄萎病的防治包括选育抗性品种、采用轮作的栽培方式、化学防治和生物防治等2。然而,目前生产上尚缺乏高抗品种,而化学杀菌剂因难以到达病原菌的靶标位点导致防治效果欠佳3,相较而言,生物防治因具有安全、环保等优势,被认为是防治棉花黄萎病最具前景的方法之一4。植物内生细菌寄生于植物组织内部,对植物不会产生危害作用。很多内生细菌能够促进植物生长和/或保护植物免受各种植物病
13、原菌以及害虫的侵害,这为其在农业上的开发利用提供了巨大的潜力。内生假单胞菌 Pseudomonas sp.作为一个重要的内生群体,已经在不同植物的不同组织中被发现,如杨树木质部汁液中5,榆树的根茎部6、柑橘树的茎部7等。研究证明内生假单胞菌具有促生和防病作用,例如内生假单胞菌能够促进如番茄8,水稻9和大豆10等作物的生长。内生铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa UICC B-40 产生的抗菌物质(2E,5E)-苯基十四甲酸-2,5-二烯酸酯化合物对革兰氏阳性菌具有抑制作用11。内生荧光假单胞菌株 Pseudomonas fluorescens PICF7 被证明能够有效
14、控制橄榄黄萎病12。可见,内生假单胞菌是一种很好的生防资源。我们之前从棉花内生细菌中筛选出的恶臭假单胞菌 HB3S-20,对棉花黄萎病表现出稳定的温室防治效果,温室防效在 60%以上13,但其防治机制尚不明确。同时,其作为生防菌的潜力也需要得到充分的评估。定殖能力是评估生防菌潜力的重要指标,也是影响生防菌防治效果的重要因素,生防菌能否定殖于植物体内以及其定殖能力的强弱与其防效正相关14。抗生素抗性驯化技术和荧光蛋白标记技术是生防菌定殖研究的两种常用方法。抗生素抗性驯化技术是较早的研究细菌定殖的方法,可以检测细菌在植物内定殖的数量,缺点是不能直观观察,同时不能分辨具有同等抗性的微生物群体15。荧
15、光蛋白标记技术具有灵敏性高、能精准定位和直观性强等优势,已经被广泛应用到根际土壤和植物内生细菌的检测和定位16,其中 GFP 蛋白是一种常用的荧光蛋白标记物。本研究将抗生素抗性驯化技术和 GFP 蛋白标记技术相结合,解析菌株HB3S-20 在棉花组织内的定殖状况,以评估其对棉花黄萎病的生防潜力。诱导抗性作用是生防菌防治植物病害的重要机制之一,诱导抗性是指生防菌通过触发植物中水杨酸、茉莉酸或乙烯信号通路诱导植物产生抗病性,引发植物体内防御酶活性的变化和防御酶蛋白的表达,进而达到抵御病原菌侵染的目的17。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是植物体内与抗性相关的重要
16、防御性氧化酶18。基于此,本研究以菌株 HB3S-20 为对象,探究了其在棉花植株中的定殖规律及其对棉花植株防御性氧化酶的影响,相关研究将有助于评估菌株 HB3S-20 作为生防菌的潜力,同时也为菌株 HB3S-20 的防治机制和应用方法的探索提供理论依据。1 材料与方法 1.1 材料 内生菌菌株 HB3S-20,从棉花组织内分离获得。大丽轮枝菌菌株 V991b,为本实验室保存。棉花品种为冀棉 11。所用的质粒 pBBR1MCS2-Tac-EGFP 购自湖北武汉淼灵生物有限公司。CAT 检测试剂盒(A007-1-1)、植物 POD 检测试剂盒(A084-3)和总 SOD 检测试剂盒(A001-
17、3)均购自中国南京建成生物有限公司。1.2 利福平抗性菌株 HB3S-20Rifr的构建 菌株 HB3S-20 保存于-80 冰箱中,用 NA 培养基活化菌株 HB3S-20,挑单菌落置于 NB 液体培养基 第 1 期 金利容等:恶臭假单胞菌 HB3S-20 在棉花中的定殖及诱导抗性研究 119 中 28、180 r/min 振荡培养14 h。用甲醇试剂配制 10 mg/mL的利福平溶液,用直径为 0.22 m 的 Millipore过滤器过滤备用。待 NA 培养基冷却至 50 55 时加入利福平溶液,使其终浓度分别为 10、20、50、100、200 和 300 g/mL,将培养基倒入培养皿
18、中制成平板,取菌株 HB3S-20 的菌液 100 L(菌液浓度为 1104 cfu/mL)在含低浓度利福平的平板上涂布培养,待长出后挑单菌落摇菌培养,再转入含高浓度利福平的平板上培养,按照设定的 6 个浓度梯度由低浓度到高浓度依次筛选,多次传代以确保获得稳定的抗性菌株。最终获得抗 300 g/mL 利福平的抗性菌株 HB3S-20Rifr用于棉花植株的定殖试验。1.3 GFP 标记菌株 HB3S-20GFP 的构建 将菌株 HB3S-20 的电击感受态细胞(30 L)与质粒 pBBR1MCS2-Tac-EGFP 的 DNA(1.2 mg/mL,80 L)在预冷的 1.5 mL 灭菌离心管中混
19、合,用电转仪(Micropulser TM,Bio-Rad,1600 V,脉冲时间为 45 ms,电击杯的电极间距为 1 mm)将质粒转入菌株 HB3S-20 的细胞中后,快速加入 300 L SOC 培养基并将混合物转移到1.5 mL的离心管中,28,180 r/min振荡培养1 h。取混合物100 L涂于含卡那霉素(50 g/mL)的 LB 培养基,置于 28 培养箱中培养 24 h,挑取多个转化子单菌落培养,提取转化子的菌株 DNA,设计一对 GFP 基因特异性引物(GFP-F:5-CAC AAG TTC AGC GTG TCC G-3,GFP-R:5-TGG GTG CTC AGG T
20、AG TGG TT-3),设计片段大小为 539 bp,用特异性引物对转化子基因组 DNA 进行 PCR 扩增验证(退火温度为 57),并在荧光显微镜下观察转化子是否发出绿色荧光。获得遗传稳定的标记菌株HB3S-20GFP 用于棉花植株的定殖试验。1.4 菌株 HB3S-20Rifr和菌株 HB3S-20GFP 对大丽轮枝菌拮抗活性的检测 采用平板对峙法检测菌株 HB3S-20Rifr和菌株 HB3S-20GFP 对大丽轮枝菌的拮抗活性。具体方法如下:大丽轮枝菌菌株 V991b 在 PDA 平板上 25 培养 2 d 后,在距菌落边缘 1.5 cm 处 4 个角分别点加 5 L 野生型菌株 H
21、B3S-20、菌株 HB3S-20Rifr和菌株 HB3S-20GFP 的菌液(菌液浓度为 1108 cfu/mL),25 条件下继续培养 5 d,以点加 5 L 无菌水作为对照,测定大丽轮枝菌的菌落直径,运用以下公式计算各菌株对大丽轮枝菌的抑制率,检测拮抗活性。计算公式如下:菌株对大丽轮枝菌的抑制率(%)=(对照大丽轮枝菌的菌落直径对峙培养后大丽轮枝菌的菌落直径)/对照大丽轮枝菌的菌落直径100。1.5 菌株 HB3S-20Rifr在棉花组织中的定殖 将菌株HB3S-20Rifr在 NA培养基中划线过夜培养,挑取单菌落置于 NB 液体培养基中 28、180 r/min振荡培养 14 h,然后
22、转入 250 mL 的锥形瓶中于相同条件下培养 48 h,8000 r/min 离心 15 min,取沉淀用无菌水调整菌体浓度为 1108 cfu/mL,将二叶期棉花幼苗的根部置于 30 mL 菌株 HB3S-20Rifr菌液中浸根处理 20 min,然后将棉花幼苗移栽到盛有营养基质的塑料钵(直径高=12 cm10 cm)中。分别于处理后第 3、5、7、9、11、13、15、20、25 和 30 d 从棉花幼苗的根部、茎基部上方 1 cm 处的茎部、茎基部上方 3 cm 处的茎部、叶片四个不同部位取样,每个处理取 3 株棉苗,棉苗用无菌水将根部和茎部冲洗5 次,并用无菌滤纸吸干表面水分,将 3
23、 株棉苗的相应组织各取少许,称取混合样品 0.1 g,用 5%次氯酸钠表面消毒 10 s,无菌水冲洗 58 次,置于灭菌研钵中用 1 mL 无菌水研磨 1 min,取悬浮液 100 L涂布于添加利福平(300 g/mL)的 NA 培养基上,28 培养 3 d,每个处理 3 个重复。若培养单菌落数在 20200 之间,对单菌落进行计数,若单菌落数过高,则用无菌水稀释后再涂布计数,菌量用每克组织的 CFU 表示。1.6 菌株 HB3S-20GFP 根部定殖的显微观察 在显微镜下观察标记菌株 HB3S-20GFP 在棉花幼苗根部的定殖状况。用自来水轻轻冲洗二叶期棉花幼苗根部,分别用浓度为 1108
24、cfu/mL 的菌株 HB3S-20GFP 和野生型菌株 HB3S-20 的菌液浸根处理 20 min,然后将棉花幼苗移栽到盛有营养基质的塑料钵(直径高=12 cm10 cm)中。分别于接种后 24、48 和 72 h 随机抽取棉花幼苗的根部组织,用刀片横切或纵切制成根临时切片。根临时切片分别在奥林巴斯 U-RFL-T显微镜和激光扫描共聚焦荧光显微镜下(laser scanning confocal microscopy,LSCM,型号为徕卡 SP8)检测。使用 MShot 图像分析系统、Leica application suite X 软件和 Adobe Photoshop CS6 作图软
25、件对图像进行分析和处理。120 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 1.7 菌株 HB3S-20 对棉株的诱导抗性试验 二叶期棉花幼苗用自来水冲洗根部后备用。共设置 4 个处理:(1)HB3S-20+Vd,先用菌株 HB3S-20的菌液(1108 cfu/mL)浸根处理 20 min,再用大丽轮枝菌的孢子液(5106孢子/mL)浸根处理 20 min。大丽轮枝菌的孢子液制备如下:大丽轮枝菌菌株 V991b 在 PDA 平板上培养 10 d,用接种环轻轻刮下孢子,再用无菌水将孢子洗脱下来并用四层无菌纱布过滤,调整孢子悬浮液为 5106孢子/mL。(2)Vd,仅用大丽轮枝菌(Vd)的孢子
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