红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3的克隆及功能鉴定.pdf
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1、植物资源与环境学报 ():收稿日期:基金项目:贵州省农业科学院国家自然科学基金后补助项目(黔农科院国基后补助)国家自然科学基金项目()贵州省科研机构创新能力建设专项(黔科合服企 号)作者简介:郑乾明()男湖北荆门人博士副研究员主要从事园艺果实品质形成机制研究通信作者:.引用格式:郑乾明 王红林 王小柯 等.红肉火龙果 淀粉酶基因 的克隆及功能鉴定.植物资源与环境学报 ():.红肉火龙果 淀粉酶基因 的克隆及功能鉴定郑乾明 王红林 王小柯 解 璞 马玉华(贵州省农业科学院:.贵州省果树科学研究所.农业农村部喀斯特山区作物基因资源与种质创新重点实验室 贵州 贵阳)摘要:为了解 淀粉酶在红肉火龙果
2、(.)果实淀粉降解中的作用对红肉火龙果 淀粉酶基因 进行克隆和生物信息学分析检测果实发育期间该酶的活性及其编码基因的表达同时对 重组蛋白的淀粉降解活性进行分析 结果表明:基因的开放阅读框长度为 编码 个氨基酸 蛋白的理论相对分子质量为 理论等电点为 .预测此蛋白位于叶绿体且为亲水性蛋白 系统进化分析表明 与拟南芥 (.).的亲缘关系最近均属于 类 亚细胞定位实验结果显示 定位于本氏烟草()叶片的叶绿体表明 具有质体定位的特点 在授粉后 和 红肉火龙果果实的 淀粉酶活性较低在授粉后 淀粉酶活性显著(.)升高在授粉后 和 淀粉酶活性保持在较高水平 红肉火龙果果实的 基因相对表达量在授粉后 和 较低
3、在授粉后 和 持续升高在授粉后 略有降低 红肉火龙果果实发育期间 淀粉酶活性与 基因相对表达量的相关性较高(.)体外淀粉降解活性实验结果显示:在含有 重组蛋白的反应体系中均检测到麦芽糖和麦芽三糖且二者含量极显著(.)高于含有载体对照 的反应体系 综合上述结果 蛋白可能定位于红肉火龙果果实的淀粉体在果实发育期间 基因上调表达 具有淀粉降解活性关键词:红肉火龙果 淀粉酶 果实发育 亚细胞定位 酵母表达 酶活中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(:.).():(.).(.).第 期郑乾明 等:红肉火龙果 淀粉酶基因 的克隆及功能鉴定 .(.).(.).(.).:(.)火龙果(.)为仙人掌
4、科()量天尺属(.)多年生 果 树 主 要 包 括 白 肉 火 龙 果 .()和 红 肉 火 龙 果 .(.)近年来火龙果在中国南方和西南地区大量种植具有良好的经济价值和生态效益 火龙果果实含有丰富的可溶性糖、有机酸、维生素、低聚糖、多酚和黄酮类成分酸甜可口营养丰富深受消费者喜爱 与白肉火龙果相比红肉火龙果还含有丰富的甜菜苷色素具有抗氧化和消炎等功效 红肉火龙果果实发育期间可溶性糖和甜菜苷色素含量快速增加淀粉含量迅速降低以达到果实成熟时的风味和口感淀粉是植物体内非结构性糖类的主要储存形态普遍存在于叶、根、茎、种子和果实等器官中 种子和果实等库器官中积累的淀粉来源于叶片可溶性糖输入后的再合成在种
5、子萌发和果实成熟时可降解为葡萄糖和麦芽糖等可溶性糖 植物体内淀粉降解主要包括磷酸化和去磷酸化、水解及跨膜转运等环节其中水解环节主要由 淀粉酶、淀粉酶、淀粉脱支酶和歧化酶等共同介导 淀粉酶的作用是水解 糖苷键将淀粉水解成可溶性的葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和少量大分子极限糊精 淀粉酶基因()参与植物的生长发育过程如水稻(.)和 谷 子 .(.).部分 参与开花、种子萌发和籽粒成熟过程 一些 也参与植物抵御逆境胁迫过程如茶树 (.).、甘薯 (.)和木薯()若干 的表达受脱落酸、低温、盐或干旱诱导园艺作物果实发育期间积累大量淀粉在特定阶段降解为可溶性糖促使果实成熟时形成独特的风味、口感和品质 番茄(.
6、)和苹果(.)果实在发育期间积累淀粉并于成熟前快速降解香蕉()和猕猴桃(.)果实在采摘前仍含有大量淀粉于采摘后快速降解为可溶性糖 的表达使 淀粉酶活性增加在果实淀粉降解中发挥重要作用 例如:低温处理下苹果果实 淀粉酶活性增加促进淀粉降解该酶活性增加是由于 个 基因的表达受低温显著诱导杧果(.)果实采后淀粉降解伴随着 基因表达和 淀粉酶活性增加香蕉果实采后成熟过程中淀粉降解为可溶性糖伴随着 淀粉酶活 性 快 速 升 高 以 及 多 个 基 因 表 达 明 显上调红肉火龙果果实与番茄和苹果类似在发育前期会积累大量淀粉在发育后期淀粉快速降解以促进可溶性糖的积累 等对黄龙果(.)果实发育多个时期开展转
7、录组测序获得一系列淀粉水解酶基因的转录本结果表明 基因可能参与淀粉降解本课题组基于红肉火龙果多组织转录组测序获得 个 基因基因数字表达结果表明 基因植 物 资 源 与 环 境 学 报第 卷可能参与果实发育期间的淀粉降解(结果未发表)本文以 为研究对象对其进行克隆和生物信息学分析并开展 亚细胞定位、淀粉酶活性、基因表达和重组蛋白淀粉降解活性分析以期了解红肉火龙果果实发育期间 淀粉酶活性变化探讨 基因在红肉火龙果果实发育期间淀粉降解过程中的生理功能 材料和方法.材料供试红肉火龙果果实采集自贵州省镇宁县的红肉火龙果种植园(东经、北纬 海拔 )品种为紫红龙()于 年 月至 月选择处于盛果期健壮、无病虫
8、害的红肉火龙果植株分别在授粉后(授粉当天记为)、和 各采集 个果实将每个时间采集的果实平均分成 组视为 个生物学重复 将果肉切成薄片液氮速冻后研磨成粉末置于 保存、备用.方法.基因克隆 使用 多糖多酚/复杂植物 快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取果肉总 利用 试剂盒宝生物工程(大连)有限公司反转录合成 以授粉后 的果肉 为模板根据 基因的转录本序列设计特异引物(正向引物序列为 反向引物序列为)使用高保真聚合酶(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)按照说明书进行 扩增扩增产物经回收、连接和转化后挑取阳性克隆送通用生物(安徽)股份有限公司测序.序 列 分 析 使 用 在 线 程 序(:.
9、/)预测开放阅读框()及其编码的氨基酸序列 使用 在线程序(:./)计算蛋白质的理论相对分子质量和理论等电点使用在线程序 (:./)、.(:./.?)和 (:./)预测蛋白质的亚细胞定位使用 在线程序(:./)预测蛋白质的亲水性使用 在线程序(:./)预测蛋白质结构域使用 软件进行氨基酸序列多重比对使用.软件采用 法构建系统进化树 值检验设置为 次重复.亚细胞定位 去除 基因 序列的终止密码子使用特异性引物(正向引物序列为 反向引物序列为 )和 高保真 聚 合 酶 按 照 说 明 书 进 行 扩 增 使 用 克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将 扩增产物插入线性化 载体的多克隆位点
10、重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞 挑选阳性克隆送通用生物(安徽)股份有限公司测序 将构建的融合表达载体()和空载体()分别转化至根癌农杆菌菌株 挑选阳性单克隆于 振荡培养至 值约.将根癌农杆菌注射至株龄 周的本氏烟草()叶片下表皮 在注射后 利用 激光共聚焦显微镜(德国 公司)观察叶片中的荧光信号.淀粉提取和 淀粉酶活性检测 参考文献中的方法提取红肉火龙果果实淀粉 以授粉后 的红肉火龙果果肉为材料称取约 粉末加入 体积分数 乙醇溶液 水浴 提取可溶性糖过滤后收集残渣重复操作 次加入 蒸馏水加热糊化 置于 保存、备用 使用 淀粉酶测试盒(苏州科铭生物技术有限公司)检测授粉后不同时间果肉中的 淀粉
11、酶活性.基因表达分析 使用 .软件设计 基因荧光定量 特异性引物(正向引物序列为 反向引物序列为 )在 红 肉 火 龙 果 基 因 组 数 据 库(:./)进行 检索确保特异性扩增 使用 试剂(北京百迈客生物科技有限公司)在荧光定量 仪(美国第 期郑乾明 等:红肉火龙果 淀粉酶基因 的克隆及功能鉴定 公司)上进行基因表达定量检测 反应体系总体积为.包含 模板.正向、反向引物各.无菌水.反应程序:预变性 变性 、退火并延伸 共 个循环 内参基因为(正向引物序列为 反向引物序列为)采用 法计算相对表达量.体外淀粉降解活性检测.在酵母中的表达及总蛋白质提取使用特异性引物(正向引物序列为 反向引物序列
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- 火龙果 淀粉酶 基因 HpAMY3 克隆 功能 鉴定
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