KDM6B通过MAPK信号通路调控肾癌细胞的增殖和迁移.pdf

作者单位:6 3 7 0 0 0 南充,川北医学院附属南充市中心医院肾病内科通信作者:袁祖君,E-m a i l:y u a n z u j u n 1 1 11 6 3.c o m实验研究K DM 6 B通过MA P K信号通路调控肾癌细胞的增殖和迁移林昌伟 袁祖君d o i:1 0.3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 4-4 6 2 4.2 0 2 4.0 1.0 0 7【摘要】目的 研究赖氨酸特异性去甲基酶6 B(K DM 6 B)表达对肾透明细胞癌增殖和迁移侵袭的影响。方法 通过基因表达谱交互分析数据库分析K DM 6 B表达与肾透明细胞癌临床分期与预后的关系。将肾透明细胞癌患者的肿瘤组织石蜡切片进行K DM 6 B免疫组化染色并统计与临床病理特征的相关性,使用敲低对照小干扰R NA以及敲低K DM 6 B小干扰R NA对人肾透明细胞癌细胞株A CHN和C a k i-1细胞分别进行转染,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(R T-q P C R)及W e s t e r n b l o t验证转染效率,使用C C K 8实验检测转染后肾透明细胞癌细胞增殖能力的变化,克隆形成实验检测细胞形成克隆的能力,使用T r a n s w e l l实验检测细胞迁移侵袭能力的变化。使用W e s t e r n b l o t实验检测丝裂原活化蛋白激酶(MA P K)信号通路中磷酸化的细胞外信号调节激酶蛋白(p-E R K)及细胞外信号调节激酶蛋白的表达水平。结果 肾透明细胞癌组织中K DM 6 B的高表达与良好的疾病分期与预后密切相关。在两种细胞系中转染s i K DM 6 B均能成功敲低K DM 6 B的表达。敲低K DM 6 B表达后肾透明细胞癌细胞A CHN和C a k i-1的细胞增殖能力显著增强,细胞克隆形成能力明显增强,细胞迁移侵袭能力显著增强。敲低K DM 6 B表达后p-E R K表达水平显著增加。结论 K DM 6 B抑制MA P K信号通路激活及肾透明细胞癌细胞进展,该蛋白可能成为诊断肾透明细胞癌的生物标记物以及治疗肾透明细胞癌的潜在靶点。【关键词】赖氨酸特异性去甲基酶6 B;肾透明细胞癌;细胞增殖;MA P K信号通路E f f e c t s o f t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n o f K DM 6 B o n c l e a r c e l l r e n a l c e l l c a r c i n o m a L I N C h a n g w e i,Y U AN Z u j u n.D e p a r t m e n t o f N e p h r o l o g y,N a n c h o n g C e n t r a l H o s p i t a l,N o r t h S i c h u a n M e d i c a l C o l l e g e,N a n c h o n g 6 3 7 0 0 0,C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Y U AN Z u j u n,E-m a i l:y u a n z u j u n 1 1 11 6 3.c o m【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o s t u d y t h e e f f e c t o f l y s i n e s p e c i f i c d e m e t h y l a s e 6 B(K DM 6 B)e x p r e s-s i o n o n t h e p r o l i f e r a t i o n,m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n o f c l e a r c e l l r e n a l c e l l c a r c i n o m a(c c R C C).M e t h-o d s G E P I A w e b s i t e w a s u s e d t o a n a l y z e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n K DM 6 B e x p r e s s i o n a n d p a t h o l o g i-c a l s t a g e a n d p r o g n o s i s o f c c R C C.H u m a n c c R C C c e l l l i n e s A CHN a n d C a k i-1 w e r e c u l t u r e d,a n d s i N C a n d s i K DM 6 B s m a l l i n t e r f e r i n g R NA w e r e s y n t h e s i z e d.A CHN a n d C a k i-1 c e l l s w e r e t r a n s f e c t-e d b y s i R NA.T h e t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y o f A CHN a n d C a k i-1 c e l l s w a s v e r i f i e d b y R T-q P C R a n d W e s t e r n b l o t.T h e p r o l i f e r a t i o n a b i l i t y o f t h e t r a n s f e c t e d c c R C C c e l l s w a s d e t e c t e d b y C C K 8 a s-s a y.C o l o n y f o r m a t i o n a s s a y w a s u s e d t o d e t e c t t h e a b i l i t y o f c e l l s t o f o r m c l o n e s,a n d t r a n s w e l l a s s a y w a s u s e d t o d e t e c t t h e m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n o f c a n c e r c e l l s.W e s t e r n b l o t a s s a y w a s u s e d t o d e t e c t MA P K s i g n a l i n g p a t h w a y a n d i t s c h a n g e s.R e s u l t s T h e h i g h e x p r e s s i o n o f K DM 6 B i n p a t i e n t s w i t h c c R C C w a s c l o s e l y r e l a t e d t o e a r l i e r d i s e a s e s t a g e a n d b e t t e r p r o g n o s i s.T h e e x p r e s s i o n o f K DM 6 B w a s s u c c e s s f u l l y k n o c k e d d o w n b y s i K DM 6 B i n b o t h c e l l l i n e s.K n o c k d o w n o f K DM 6 B e x-p r e s s i o n s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e d t h e p r o l i f e r a t i o n a b i l i t y,c e l l c l o n o g e n e s i s a b i l i t y,a n d c e l l m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n a b i l i t y o f c c R C C c e l l s A CHN a n d C a k i-1.A f t e r k n o c k d o w n o f K DM 6 B e x p r e s s i o n,p-E R K e x p r e s s i o n l e v e l i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y.C o n c l u s i o n s K DM 6 B s u p p r e s s e s t h e MA P K s i g n a-l i n g p a t h w a y a n d t h e c a n c e r p r o g r e s s i o n i n c c R C C,w h i c h m a y b e a b i o m a r k e r f o r t h e d i a g n o s i s o f c c R C C a n d a p o t e n t i a l t a r g e t f o r t h e t r e a t m e n t o f c c R C C.33现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 4年2月第1 6卷第1期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,F e b r u a r y 2 0 2 4,V o l 1 6,N o.1【K e y w o r d s】K DM 6 B;C l e a r c e l l r e n a l c a r c i n o m a;C e l l p r o l i f e r a t i o n;MA P K s i g n a l i n g p a t h w a y 肾细胞癌(r e n a l c e l l c a r c i n o m a,R C C)已成为泌尿生殖系统最常见的肿瘤之一,约占所有恶性肿瘤的3%1。而其中最常见的亚型为肾透明细胞癌(c l e a r c e l l r e n a l c e l l c a r c i n o m a,c c R C C),约占R C C的8 0%9 0%2。在首次诊断时,约有2 5%3 0%的c c R C C患者已经出现转移3。因此,研究c c R C C的发生发展机制,寻找新的生物标志物和潜在的治疗靶点对于c c R C C诊疗具有重要意义。组蛋白甲基化异常是肿瘤细胞中常见的表观遗传学改变之一,针对相关基因进行靶向治疗能否成为恶性肿瘤的关键潜在治疗策略也成为肿瘤研究的热点4。赖氨酸特异性去甲基酶6 B(l y s i n e s p e c i f i c d e m e t h y l a s e 6 B,K DM 6 B)是J u m o n j i C组蛋白去甲基化酶家族的成员,其作用是特异性去除组蛋白H 3的第2 7个氨基酸的甲基化修饰,从而影响基因的转录调控。K DM 6 B广泛参与细胞的分化、增殖、衰老和凋亡过程,是细胞应对环境压力做出应激反应的关键调控基因。在多种病理生理过程中,赖氨酸特异性去甲 基酶蛋白 家族的成 员 发 挥 双 重 作用5-7。在某些人类癌症(如非小细胞肺癌8和结直肠癌9)中,K DM 6 B基因表达显著下调,然而在其他 情 况 下(如 食 管 鳞 状 细 胞 癌1 0和 肝 癌1 1),K DM 6 B的表达水平在癌组织中显著升高。尽管对K DM 6 B已有一定的研究,但对其在c c R C C中的表达情况及具体作用机制仍知之甚少。因此,本研究旨在探究K DM 6 B异常表达在c c R C C中的潜在临床意义,并研究K DM 6 B对c c R C C细胞增殖和迁移侵袭能力的影响及潜在的下游效应。材料与方法一、实验材料与组织样本c c R C C组织蜡块来源于在我院诊疗的4 2名患者。排除标准:年龄小于1 8岁患者;缺乏完整临床病理资料的患者;既往有其他恶性肿瘤病史的患者;预期寿命7 5%计4分,将两项评分相乘得出最终评分结果,小于6分定为低表达组,大于等于6分定为高表达组。两名病理学医师独立评估免疫组化结果,评估不一致的免疫组化染色由两名医师协商得出最终染色结果。四、细胞培养人源肾透明细胞癌细胞系A CHN和C a k i-1细胞系 购 自AT C C并 经 过S T R鉴 定。A CHN用1 6 4 0培养基培养,C a k i-1用MC C OY S 5 A培养基培养,培养液中均添加1 0%胎牛血清(E a l l b i o),1%l-谷氨酰胺(G i b c o),1%非必需氨基酸溶液(G i b c o)和1%青霉素-链霉素(G i b c o,1 0 3 7 8 0 1 6,1 0 0 U/m L青霉素,1 0 0 g/m L链霉素)。细胞培养在3 7 C,5%C O2的培养箱中。五、细胞转染实验 为了抑制K DM 6 B的表达,我们使用R NA i M-A X(I n v i t r o g e n)将s i R NA用L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0试剂(I n v i t r o g e n)转染到细胞中。第1天将一定量的细胞接种于6-w e l l细胞板(C o r n i n g),使其第二天密度达5 0%左右,将无血清培养基溶解的s i R NA与无血清培养基溶解的R NA i MA X等体积轻轻混匀后静置1 5 m i n,缓慢加入细胞中。第2天更换新鲜的培养基,转染4 8 h后,进行后续实验。小干扰R NA序 列:s i-K DM 6 B:GAGA C C U C GUGUG-GAUUAA;n e g a t i v e c o n t r o l(N C)5-UU C U C-C GA A C GUGU C A C GU-3。六、R NA提取与实时荧光定量聚合酶链式反应(r e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,R T-q P C R)使用T R I z o l试 剂(1 5 5 9 6 0 2 6,L i f e T e c h n o l o-g i e s)从肾透明细胞癌细胞中提取总R NA,并使用H i g h-C a p a c i t y c D NA r e v e r s e T r a n s c r i p t i o n K i t(4 3 6 8 8 1 4,A p p l i e d B i o s y s t e m s)将2 g R NA反转录为c D NA。然 后 用S Y B R G r e e n/R O X q P C R M a s t e r M i x(K 0 2 5 1,T h e r m o S c i e n t i f i c)作为模板进行指数扩增。b e t a-a c t i n作为内参。K DM 6 B上游引 物:T T G G G C AA C T G T A C GAG T C AG,下 游引物:C C AT AG T T C C G T T T G T G C T C AAG。a c t i n上 游 引 物:GAT C AT T G C T C C T C C T GAG C,下 游引 物:A C T C C T G C T T G C T GAT C C A C。V E G F R 1上 游 引 物:GAAAA C G C AT AAT C T G G GA C AG-T,下 游 引 物:G C G T G G T G T G C T T AT T T G GA。A L K上游引物:T C T C AT C G C AG C C GAT AT G G,下 游 引 物:G G C AT C T C C T T AGAA C G C T C T。F G F R 2上 游 引 物:AG C A C C AT A C T G GA C C AA-C A C下 游 引 物:G G C AG C GAAA C T T GA C AG-T G。R YK上游引物:C C C AG G T C AA C AT T T C T-G T T C A,下 游 引 物:T G C C AG T A C AG GAAAG C-T C T A C。七、W e s t e r n b l o t实验贴壁生长的细胞用冷的P B S洗3次,加入含蛋白酶抑制剂PM S F的R I P A裂解液在冰上裂解3 0 m i n。细胞裂解液离心后收集上清。使用B C A试剂盒(P C 0 0 2 0,S o l a r b i o)对蛋白浓度进行定量。等量(3 0 g)的总蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到0.4 5 m P V D F膜上。在室温下用5%牛血清白蛋白(B S A)在T B S T缓冲液中封闭膜2 h后,在4与一抗孵育过夜。用T B S T缓冲液洗涤膜3次,然后在室温下与过氧化物酶(HR P)偶联二抗孵育1 h。使用超强化学发光E C L试剂盒检测特异性抗体结合。荧光信号由荧光图像分析仪检测。八、细胞存活率和克隆形成试验使用C C K-8试剂盒来测量K DM 6 B敲低对肾透明细胞癌细胞增殖的影响。将细胞以1 0 0 0个细胞/孔的密度接种于9 6孔细胞板,并在2 0 0 l的培养基中生长过夜。第2天开始,分别在之后的0、2 4、4 8、7 2、9 6 h,每孔加2 0 l C C K-8试剂,3 7孵育3 h。最后,用酶标仪在4 5 0/6 5 0 n m处测量吸光度(o p t i c a l d e n s i t y,O D)。对于克隆形成实验,在6-w e l l细胞板中每个孔种6 0 0个细胞。其间每4 d更换一次培养基,2周后,用磷酸盐缓冲盐水(P B S)洗涤3次,4%多聚甲醛固定2 0 m i n,0.5%结晶紫染色1 5 m i n,然后计数。九、T r a n s w e l l细胞迁移侵袭实验在2 4孔室板中,使用8 m孔的t r a n s w e l l小室进行细胞迁移和侵袭检测。t r a n s w e l l室预涂(侵袭试验)或不涂(迁移试验)M a t r i g e l 胶(B D B i o s c i-e n c e s)。底室充入含1 0%胎牛血清的培养基5 0 0 l,上室充入不含1 0%胎牛血清的21 04细胞培养液2 0 0 l,并于培养箱中继续培养2 4 h(迁移实验)或4 8 h(侵袭试验)。然后,细胞表面膜的底部固定在4%聚甲醛3 0 m i n和沾0.1%结晶紫2 0 m i n。每组随机选取5个显微镜进行细胞数统计。十、统计学方法使用S P S S 2 3.0统计学软件对数据进行统计分析,使用G r a p h p a d p i s m 9.5绘图,使用K a p l a n-M e i e r分析对患者的生存期进行分析,对所有计量资料进行t 检验,对所有计数资料进行2检验,P0.0 5表示差异有统计学意义。53现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 4年2月第1 6卷第1期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,F e b r u a r y 2 0 2 4,V o l 1 6,N o.1结 果一、免疫组化检测K DM 6 B在肾透明细胞癌中的表达我们首先运用免疫组化染色在肾透明细胞癌中对K DM 6 B进行表达的检测,在4 2例肾透明细胞癌患者的组织中,有2 6例呈K DM 6 B高表达(评分6),1 6例呈K DM 6 B低表达(评分 6)(图1 A、B),4 2例患者的临床病理特征见表1,我们对K DM 6 B的表达和临床病理特征进行分析,发现K DM 6 B的高表达患者其肿瘤直径更小(图1 C,表1),T分期(图1 D,表1)、N分期(图1 E,表1)、M分期更低(图1 F,表1),且K DM 6 B高表达患者有更长的总生存期(图1 B)。上述结果表明,K DM 6 B低表达与患者预后不良显著相关,其可能是肾透明细胞癌的一个重要的生物标志物。A:免疫组化染色检测K DM 6 B在肾透明细胞癌中的表达情况(免疫组化染色法,显微镜下放大2 0 0倍观察);B:K DM 6 B表达水平高低与患者总生存期的关系;C:K DM 6 B表达水平高低与患者肿瘤大小的关系;D:K DM 6 B表达水平高低与患者T分期的关系;E:K DM 6 B表达水平高低与患者N分期的关系;F:K DM 6 B表达水平高低与患者M分期的关系(*表示P0.0 5,*表示P0.0 1)图1 K DM 6 B与肾透明细胞癌临床病理特征关系表1 不同临床病理特征患者K DM 6 B表达水平比较临床病理特征例数K DM 6 B低表达(n=2 6)K DM 6 B高表达(n=1 6)2 值P 值性别0.1 6 20.6 8 8 男3 01 81 2 女1 284年龄(岁)0.0 2 00.8 8 7 2.5 c m2 21 75T分期5.0 6 40.0 2 4 T1T22 51 21 3 T3T41 71 43N分期4.2 7 30.0 3 9 N02 31 11 2 N1N31 91 54M分期4.3 2 50.0 3 8 M03 01 61 4 M11 21 02 二、G E P I A网站分析K DM 6 B表达与肾透明细胞癌分期与预后的关系 我们利用G E P I A网络工具分析了T C GA数据库中的不同K DM 6 B表达水平的肾透明细胞癌患者的临床分期和预后是否具有显著差异。如图2 A所示,、期患者的K DM 6 B表达水平显著高于、63现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 4年2月第1 6卷第1期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,F e b r u a r y 2 0 2 4,V o l 1 6,N o.1期的患者;如图2 B及2 C所示,K DM 6 B高表达的患者,总生存期和无病生存期均显著高于低表达患者。这些结果说明K DM 6 B可能与肾透明细胞癌发生发展相关。A:K DM 6 B表达与肾透明细胞癌临床分期的关系,纵坐标为K DM 6 B表达量对数值,横坐标为肾透明细胞癌患者分期,上图说明K DM 6 B低表达与更晚的分期相关;B:K DM 6 B表达与肾透明细胞癌患者总生存期长度的关系;C:K DM 6 B表达与肾透明细胞癌患者总生存期长度的关系。图2 G E P I A网站分析K DM 6 B表达与肾透明细胞癌分期与预后的关系 三、小干扰R NA转染敲低K DM 6 B的效率检测本研究分别从mR NA表达水平与蛋白表达水平对小干扰R NA转染A CHN和C a k i-1细胞的转染效率进行验证。R T-q P C R验证A CHN和C a k i-1细胞系中转染小干扰R NA后K DM 6 B的mR NA表达水平,结果显示在A CHN和C a k i-1细胞系中,与阴性对照组相比,转染小干扰R NA实验组 的K DM 6 B表达水平显著降低(图3 A)。我们还通过W e s t e r n b l o t实验验证K DM 6 B蛋白水平的敲低效率,与mR NA水平结果一致,转染小干扰R NA实验组的K DM 6 B蛋白表达水平明显比对照组低(P0.0 5)(图3 B),这些结果表明小干扰R NA转染A CHN和C a k i-1细胞后有效地敲低了K DM 6 B的表达。A:R T-q P C R检测转染敲低K DM 6 B小干扰R NA实验组中K DM 6 B的mR NA表达水平显著低于阴性对照组;B:W e s t e r n b l o t检测转染小干扰R NA实验组中K DM 6 B的蛋白表达水平显著低于阴性对照组图3 小干扰R NA可有效敲低肾癌细胞中K DM 6 B的表达 四、K DM 6 B基因敲低对A CHN和C a k i-1细胞增殖的影响我们使用C C K 8法检测敲低K DM 6 B后不同时间点肿瘤细胞的活性验证K DM 6 B对细胞增殖能力的影 响,如 图4 A、B所 示,与 对 照 组 相 比,敲 低K DM 6 B实验组中A CHN和C a k i-1细胞的增殖能力显 著 增 高(P0.0 5)。如 图4 C-D所 示,在A CHN和C a k i-1细胞系中敲低K DM 6 B后,与阴性对照组相比,敲低组中细胞克隆形成率明显增多(P0.0 5)。表明敲低K DM 6 B后A CHN和C a k i-1细胞的克隆形成显著增加。以上表明在肾透明细胞癌细胞中敲低K DM 6 B可以有效促进肿瘤细胞的增殖活性。五、K DM 6 B基因敲低对A CHN和C a k i-1细胞迁移侵袭的影响我们使用T r a n s w e l l实验检测敲低K DM 6 B后对细胞增殖能力的影响,如图5所示,与对照组相比,敲低K DM 6 B实验组中A CHN和C a k i-1细胞的迁 移 和 侵 袭 能 力 显 著 增 高(P0.0 5)。表 明K DM 6 B可以影响肾透明细胞癌细胞的上皮间质转73现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 4年2月第1 6卷第1期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,F e b r u a r y 2 0 2 4,V o l 1 6,N o.1化进程,抑制肿瘤的转移。A:C C K-8法检测敲低K DM 6 B对肾透明细胞癌细胞系A CHN增殖能力的影响;B:C C K-8法检测敲低K DM 6 B对肾透明细胞癌细胞系C a k i-1增殖能力的影响;C:克隆形成实验检测敲低K DM 6 B对肾透明细胞癌细胞系A CHN克隆形成能力的影响;D:克隆形成实验检测敲低K DM 6 B对肾透明细胞癌细胞系C a k i-1克隆形成能力的影响图4 敲低K DM 6 B可以影响肾透明细胞癌细胞增殖活性A:t r a n s w e l l法检测敲低K DM 6 B对肾透明细胞癌细胞系A CHN迁移及侵袭能力的影响;B:t r a n s w e l l法检测敲低K DM 6 B对肾透明细胞癌细胞系C a k i-1迁移及侵袭能力的影响;C:t r a n s w e l l法检测肾透明细胞癌细胞系A CHN迁移及侵袭能力的柱状统计图(与对照组相比,*表示P0.0 1);D:t r a n s w e l l法检测肾透明细胞癌细胞系C a k i-1迁移及侵袭能力的柱状统计图(与对照组相比,*表示P0.0 1)图5 T r a n s w e l l实验检测敲低K DM 6 B基因对肾透明细胞癌细胞迁移侵袭能力的影响 六、K DM 6 B基因敲低可激活A CHN和C a k i-1细胞 的 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶(m i t o g e n-a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e,MA P K)信号通路MA P K通路是肿瘤的重要促癌信号通路,其中以细胞外信号调节激酶蛋白(e x t r a c e l l u l a r s i g n a l-r e g u l a t e d k i n a s e,E R K)为特征蛋白的级联反应主83现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 4年2月第1 6卷第1期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,F e b r u a r y 2 0 2 4,V o l 1 6,N o.1要代表对生长因子和有丝分裂原的反应,从而有利于细胞的生长、分化和存活1 4。本研究中为了进一步探究K DM 6 B作用于肾透明细胞癌的机制,我们通过W e s t e r n B l o t检测了MA P K信号通路激活指标磷酸化E R K的表达水平,结果显示,在A CHN和C a k i-1细胞系中,与对照组相比,敲低K DM 6 B后E R K的活化形式磷酸化的细胞外信号调节激酶蛋白(p h o s p h o r y l a t e d e x t r a c e l l u l a r s i g n a l-r e g u l a t e d k i n a s e,p-E R K)的表达水平明显增加,但总E R K表达的水平没有明显变化(图6 A)。p-E R K的表达水平极大的受其 上游众多络 氨酸激酶(R e c e p t o r t y r o s i n e k i n a s e s,R T K s)表达的影响,因此我们检测了A CHN和C a k i-1细胞系中K DM 6 B敲低后几个常见的R T K s的表达变化,发现它们的表达水平在K DM 6 B敲 低 后 均 有 不 同 程 度 的 上 调,说 明K DM 6 B可 能 是 通 过 下 调R T K s的 表 达 抑 制MA P K信号通路,进而促进癌细胞增殖(图6 B、C)。A:W e s t e r n B l o t检测A CHN和C a k i-1细胞系中沉默K DM 6 B表达可激活MA P K通路;B:R T-q P C R检测在肾透明细胞癌细胞系A CHN敲低K DM 6 B后R T K s的表达变化;C:R T-q P C R检测在肾透明细胞癌细胞系C a k i-1敲低K DM 6 B后R T K s的表达变化图6 敲低K DM 6 B激活肾透明细胞癌细胞MA P K信号通路活性讨 论K DM 6 B是一种重要的组蛋白去甲基化酶,在炎症、发育、衰老和癌症等多种病理生理过程中发挥关键作用8。有研究指出在非小细胞肺癌患者中,血清K DM 6 B mR NA水平降低,并且随着临床分期和淋巴结转移的增加,血清K DM 6 B mR NA水平降低的趋势更加明显1 3。然而,K DM 6 B也可以通过多种机制发挥癌基因的作用,包括促进增殖、炎症和细胞迁移,以及抑制细胞的分化和凋亡等。本研究结果表明,降低K DM 6 B的表达会显著增强c c R C C细胞的增殖和迁移能力;生物信息学分析和免疫组化实验证实,在进展期c c R C C中,K DM 6 B的表达明显下降,提示患者预后不良。综合本研究的实验结果,K DM 6 B是影响c c R C C患者临床病理分期和长期预后的关键因素之一。检测K DM 6 B表达水平可能成为预测患者预后的潜在生物标志物。MA P K通路通过一系列关键激酶传递细胞内外信号1 4。MA P K通路活化过程存在两类经典的级联反应:以激活E R K为特征的级联反应,主要受到生长因子和有丝分裂原的调控,从而有利于细胞的生长、分化和存活。相反,以应激活化蛋白激酶参与为主要特征的级联反应,主要受到细胞应激和炎症刺激的激活,因此激活后有利于细胞出现分化、凋亡和炎症反应1 5。因此,本研究探究了K DM 6 B对MA P K通路活性的影响,并发现敲低K DM 6 B表达水平可显著激活MA P K通路活性。作为MA P K通路上 游 分 子,R T K s的 表 达 水 平 直 接 影 响 到MA P K通路的激活程度。为了深入研究K DM 6 B敲低 激 活MA P K通 路 的 具 体 机 制,我 们 检 测 了K DM 6 B敲低后R T K s的表达变化,结果显示,在K DM 6 B敲低后,多种R T K s的mR NA水平显著升高。这表明K DM 6 B可能通过抑制R T K s表达来抑制MA P K活性,从而验证了其在c c R C C中作为抑癌基因的作用机制。综上所述,本研究确认了K DM 6 B在肾透明细胞癌中作为一种重要的表观遗传修饰物,并与患者的疾病分期和预后密切相关。降低K DM 6 B表达后增强肿瘤细胞的增值和迁移侵袭能力,并激活了MA P K信号通路。因此,本研究为肾透明细胞癌的预后提供了一个重要的新的生物标志物和潜在治疗的新靶点。参 考 文 献1 B r a y F,F e r l a y J,S o e r j o m a t a r a m I,e t a l.G l o b a l c a n c e r s t a-t i s t i c s 2 0 1 8:G L O B O C AN e s t i m a t e s o f i n c i d e n c e a n d m o r t a l i-93现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 4年2月第1 6卷第1期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,F e b r u a r y 2 0 2 4,V o l 1 6,N o.1t y w o r l d w i d e f o r 3 6 c a n c e r s i n 1 8 5 c o u n t r i e sJ.C a n c e r J C l i n,2 0 1 8,6 8(6):3 9 4-4 2 4.2 L j u n g b e r g B,B e n s a l a h K,C a n f i e l d S,e t a l.E AU g u i d e l i n e s o n r e n a l c e l l c a r c i n o m a:2 0 1 4 u p d a t eJ.E u r U r o l,2 0 1 5,6 7(5):9 1 3-9 2 4.3 L i n e h a n WM,R i c k e t t s C J.T h e m e t a b o l i c b a s i s o f k i d n e y c a n c e rJ.S e m i n C a n c e r B i o l,2 0 1 3,2 3(1):4 6-5 5.4 S o n g Y,W u F,W u J.T a r g e t i n g h i s t o n e m e t h y l a t i o n f o r c a n c e r t h e r a p y:e n z y m e s,i n h i b i t o r s,i o l o g i c a l a c t i v i t y a n d p e r s p e c t i v e sJ.J H e m a t o l O n c o l,2 0 1 6,9(1):4 9.5 S a l m i n e n A,K a a r n i r a n t a K,H i l t u n e n M,e t a l.H i s t o n e d e m e t h y l a s e J u m o n j i D 3(J M J D 3/K DM 6 B)a t t h e n e x u s o f e p i g e n e t i c r e g u l a t i o n o f i n f l a mm a t i o n a n d t h e a g i n g p r o c e s sJ.J M o l M e d(B e r l),2 0 1 4,9 2(1 0):1 0 3 5-1 0 4 3.6 Z h a n g X,L i u L,Y u a n X,e t a l.J M J D 3 i n t h e r e g u l a t i o n o f h u m a n d i s e a s e sJ.P r o t e i n C e l l,2