GM130通过14-3-3ζ对卵巢癌细胞增殖的影响及机制研究.pdf
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1、论著 通过 对卵巢癌细胞增殖的影响及机制研究郑依果,易永芬,罗祎基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:)作者单位:重庆,重庆医科大学基础医学院 分子医学与肿瘤研究中心;重庆,重庆医科大学 分子医学检测中心;重庆,重庆医科大学附属第一医院 病理科;重庆,重庆医科大学附属第一医院 妇科第一作者:郑依果,女,硕士在读,研究方向:肿瘤分子病理,:通信作者:罗祎,女,博士,副主任医师,研究方向:妇科肿瘤学,:【摘要】目的 探讨高尔基体基质蛋白()通过 对卵巢癌细胞增殖的影响及可能机制。方法 采用免疫组化法检测在 例正常卵巢上皮组织和 例卵巢上皮恶性肿瘤中 和 的表达,分析二者相关性。采用 和 法检测
2、卵巢癌 细胞株 和 蛋白及其 表达情况,筛选出高表达细胞株。采用免疫荧光染色法检测 与 在卵巢癌细胞中的共表达情况。将设计好的重组表达质粒 片段稳转进入卵巢癌细胞中,采用 和 筛选出降低 的最佳片段。细胞分为三组:空白组()、对照组()、低表达组(),采用 法和流式细胞术分别检测各组卵巢癌细胞生殖情况及周期变化情况,采用 法检测各组、及增殖相关蛋白表达水平。结果 和 在卵巢恶性肿瘤组织中的表达水平高于正常卵巢组织()。在卵巢恶性肿瘤组织中,和 呈正相关关系(,)。蛋白及其 在 细胞中的表达量高于 细胞(),蛋白及其 在 细胞和 细胞中比较差异无统计学意义()。后续实验选用 细胞。免疫荧光共定位
3、染色显示,与 主要在胞质表达,前者近核膜部分呈堆叠样表达量较高,后者胞核中表达较少,二者可能存在共定位关系。转染 组片段后,对 的抑制效果最好。转染质粒 组细胞增殖能力降低,细胞在 期阻滞的数量增多,期阻滞数量减少,期阻滞的细胞数量稍减少,、蛋白相对表达水平降低,蛋白相对表达水平升高()。结论抑制 可抑制卵巢癌细胞增殖,其机制可能与抑制 表达,影响卵巢癌细胞周期有关。【关键词】卵巢癌;高尔基体基质蛋白;细胞增殖;细胞周期:文章编号:(),(,;,;,;,):,:【】()中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ,:(),(),(),(),(,)(),(),(),【】;卵巢癌发病率占所有妇科恶性肿瘤
4、的,但病死率却高居首位,晚期卵巢癌的 年生存率仅为。目前,临床治疗卵巢癌的主要策略是在肿瘤细胞减灭术的基础上辅助铂类药物化疗,初始治疗阶段效果较好,但部分患者常因化疗耐药性导致疗效不佳。因此,深入研究卵巢癌的生长和扩散机制,探寻其在分子层面的特征和变化,对于提高卵巢癌的诊疗效率和开发新的治疗策略意义重大。研究发现,高尔基体基质蛋白(,)在细胞内扮演着多重角色,参与一系列关键的生物学过程,与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切。蛋白家族在细胞生物学中扮演着极其多样化的角色,在细胞代谢、基因调控、信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡以及细胞恶变等多个领域都发挥重要作用。蛋白是 蛋白家族中的一个重要亚型,在细
5、胞生物学行为调控中起着关键作用。近来有研究证实,干扰 蛋白功能可激发细胞内凋亡信号途径,导致细胞周期进程紊乱,从而抑制肿瘤细胞增殖。本研究通过分析 低表达对 表达及卵巢癌细胞增殖的影响,探讨 调节 影响卵巢癌细胞增殖的潜在机制。材料与方法 材料与设备材料:人卵巢癌、细胞株购自中科院上海细胞库。例正常卵巢上皮组织和 例卵巢上皮恶性肿瘤组织由医院组织标本库提供。培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、脂质体 购自 公司;缓冲液、缓冲液、蛋白裂解液购自美国 公司;免疫组织化学检测试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒、染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;电化学发光试剂盒、试剂盒、逆转录试剂盒、反转录酶、溶液购自宝日
6、医生物技术(北京)有限公司;兔抗人多克隆抗体、兔抗人 和 中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ,多克隆抗体购自英国 公司;阴性对照质粒、质粒和引物由 公司合成。设备:细胞培养箱、台式离心机购自美国 公司;转膜仪购自美国 公司;酶标仪购 自 赛 默 飞 世 尔 科 技(中 国)有 限 公 司;凝胶成像系统,购自美国 公司;倒置荧光显微镜购自日本 公司;型流式细胞仪购自美国 公司。免疫组化法检测 和 的表达将正常卵巢上皮组织和卵巢上皮恶性肿瘤组织样本经 多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋切片(厚度)。将切片放入不同浓度的二甲苯和酒精溶液中,以逐步进行脱蜡和水化处理。使用柠檬酸钠抗原修复液,通过微波炉对样
7、本进行抗原修复。修复后,将切片浸泡在磷酸盐缓冲液中,并滴加 过氧化氢以消除潜在的过氧化氢酶干扰。随后将 和 一抗稀释液(:)滴加到标本玻片上,并在 条件下孵育过夜。次日,将湿盒取出,逐渐恢复至室温,并根据超敏二步法试剂盒说明书指导,进行 染色,苏木素染核,依次进行盐酸酒精分化、返蓝以及脱水封片等步骤,在显微镜下观察。本研究通过双盲法对样本进行评估和判定。细胞复苏、培养将人卵巢癌细胞系 和 分别接种到含有 胎牛血清的 培养基中,置于一个细胞培养箱中,该箱内的环境参数被严格控制在 、的 以及饱和湿度。密切监控细胞生长情况,当细胞密度达到培养皿面积的 左右,使用 的胰蛋白酶对细胞进行消化处理,按 比
8、例稀释进行传代培养。从传代 次后的细胞中筛选出生长状态良好、正处于对数生长期的细胞,用于后续实验。卵巢癌细胞筛选 检测卵巢癌 细胞株 和 蛋白表达情况采用 裂解液对细胞蛋白质进行提取,这一过程在冰浴中进行。提取完成后,使用 蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行定量分析。总蛋白按照 泳道加入 分离胶,电泳装置设定为,运行 。加入浓缩胶,将电压提升至 ,继续电泳 。电泳完成后,将提前准备好的 膜在甲醇中预激 ,将电泳分离的蛋白质转移到 膜上。在 的脱脂牛奶中封闭 ,使用 清洗膜 次,在 条件下过夜孵育一抗()和()。次日,使用 清洗膜 次,孵育二抗()。再次使用 清洗膜 次,置于显影仪中进行显影。实验重
9、复 次,取平均值。检测卵巢癌 细胞株 和 表达情况采用 试剂盒对细胞样本中的总 进行提取并测定其浓度和纯度。依据 逆转录反应说明书,使用 反转录酶将提取的总 逆转录成。反应首先在 下进行预变性,以达到充分变性的目的,然后进入循环扩增阶段,每个循环包含 下变性 ,下退火 ,以及 下延伸 ,共进行 个循环以确保扩增的效率和特异性。作为内参基因,采用 方法来计算目的基因相对表达量,实验重复 次,取平均值。各引物序列详见表。选择 蛋白和 相对表达量最高的卵巢癌细胞进行后续实验。表 引物序列引物名称上游引物下游引物 免疫荧光染色法检测 与 在卵巢癌细胞中的共表达情况将 抗体与 稀释的 抗体混合,滴加至预
10、先准备好的载玻片上,并在置于湿盒中的样本上覆盖一层密封膜。将载玻片放入 冰箱中孵育,接着将样本置于 恒温箱中,避光条件下继续实验。向样本中滴加 标记的抗兔抗体和 标记的抗小鼠抗体,每种抗体稀释至 ,这一孵育过程持续,使用(稀释)进行核复染 。为确保实验结果的可靠性,使用兔 作为同型对照,以排除非特异性结合的可能性。最后,使用正置荧光显微镜获取样本的图像数据。细胞分组与转染选取传代 次、处于对数生长期且生长状态优秀的卵巢癌细胞,以每孔 个的密度接种于 孔细胞培养板中,置于 恒温、以及饱和中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ,湿度的细胞培养箱中培养,待细胞充分贴壁生长后,将细胞随机分配至 个不同
11、的实验组,分别为空白对照组()、阴性对照组()以及四个 干预组(、)。每组都设置 个平行复孔。培养 后,阴性对照组()给予 和阴性对照质粒的共同转染,而其余的 干预组别分别使用 与针对 蛋白的不同 质粒分别为()、()、()、()进行转染。空白对照组()并未接受任何形式的转染处理,作为自然生长状态的对照。转染过程进行 后,所有组别的细胞均被转移到含有 胎牛血清的 培养基中,并在相同的环境条件下继续培养。随后,细胞被收集起来,并按照之前描述的方法(节)对 蛋白及其 的相对表达量进行检测与分析。筛选出 低表达的最佳片段。法检测各组细胞增殖能力转染步骤完成后,向每个孔中加入 溶液,然后将细胞培养板放
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