‘怀玉山’高山马铃薯叶绿体基因组特征及密码子使用偏好性分析.pdf
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1、怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组特征及密码子使用偏好性分析洪森荣1,2,3,4,张牧彤1,徐子林1,张钦荣1,罗雨欣1,田文慧1,王心雨1(1.上饶师范学院生命科学学院,江西上饶334001;2.上饶农业技术创新研究院,江西上饶334001;3.上饶师范学院上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室,江西上饶334001;4.上饶师范学院上饶市薯芋类作物种质保存与利用重点实验室,江西上饶334001)摘要:【目的目的】分析怀玉山高山马铃薯 Solanum tuberosumvar.cormosusHuaiyushan叶绿体基因组特征及密码子使用偏好性,为开展怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组密码子优化、
2、叶绿体基因组改造,探索物种进化和增加外源基因表达等研究提供参考依据和理论基础。【方法方法】采用高通量测序技术对怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组进行测序,并利用生物信息学分析软件对组装和注释后的叶绿体基因组进行结构、基因组成及密码子偏好性分析。【结果结果】怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组大小为 155296bp,为经典的 4 段式结构。大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSC)和反向重复区(IR)长度分别为 85737、18373、25593bp,总鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比例(GC 比例)为 37.88%,共注释出133 个基因,包含 87 个编码区(CDS)基因、37 个 tRNA 基因、8 个 rRN
3、A 基因和 1 个假基因。怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组中共检测到 38 个简单重复序列位点(SSR 位点,36 个单碱基重复和 2 个双碱基重复)和 32 个长重复序列(16 个正向重复和 16 个回文重复)。怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组核苷酸多样性为 00.13927,高变区主要分布在大单拷贝区和小单拷贝区,大单拷贝区 trnL-UAA-trnF-GAA、cemA、rps12-exon1-clpP1、clpP1 基因变异率最高,小单拷贝区 rpl32-trnL-UAG、ycf1 基因变异率最高。怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组 87 个 CDS 基因的平均有效密码子数(ENC)为 47.29,E
4、NC45 的基因有 60 个,密码子偏性较弱。怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组密码子偏好以 A、U 结尾,使用偏性很大程度上受自然选择的影响,而受突变压力的影响小。CGU、AAA、CUU、GUU、GGA、GUA、GGU、UCA、GCU、CCU 为怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组的 10 个最优密码子。【结论结论】怀玉山高山马铃薯与马铃薯栽培种 S.tuberosumDesiree亲缘关系较近。图 5 表 3 参 41关键词:怀玉山高山马铃薯;叶绿体基因组;序列特征;密码子偏好性;最优密码子;系统发育分析中图分类号:S532文献标志码:A文章编号:2095-0756(2024)01-0092-12Chl
5、oroplastgenomecharacteristicsandcodonusagepreferenceofSolanum tuberosumvar.cormosusHuaiyushanHONGSenrong1,2,3,4,ZHANGMutong1,XUZilin1,ZHANGQinrong1,LUOYuxin1,TIANWenhui1,WANGXinyu1(1.CollegeofLifeSciences,ShangraoNormalUniversity,Shangrao334001,Jiangxi,China;2.ShangraoAgriculturalTechnology Innovati
6、on Research Institute,Shangrao 334001,Jiangxi,China;3.Key Laboratory of Protection andUtilizationofMedicinalandEdiblePlantResourcesinShangraoCity,ShangraoNormalUniversity,Shangrao334001,Jiangxi,China;4.KeyLaboratoryofGermplasmConservationandUtilizationofPotatoandTaroCropsinShangraoCity,ShangraoNorma
7、lUniversity,Shangrao334001,Jiangxi,China)收稿日期:2023-02-20;修回日期:2023-10-30基金项目:国家自然科学基金资助项目(32060092,31960079);2022 年上饶市科技专项项目(2022A008);江西省科技厅重点研发计划一般项目(20192BBF60006,20202BBF63001);江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ201704,GJJ211729);江西省现代农业产业技术体系建设专项(JXARS-13-赣东站);上饶市科技局平台载体建设项目(2020I001,2020J001)作者简介:洪森荣(ORCID:000
8、0-0002-9219-8303),教授,从事植物生物技术研究。E-mail:浙江农林大学学报,2024,41(1):92103Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20230169Abstract:ObjectiveThisstudyaimstoanalyzethechloroplastgenomecharacteristicsandcodonusagepreferenceofSolanum tuberosumvar.cormosusHuaiyushan,soastoprovideareferencea
9、ndtheoreticalbasisforfutureresearchonchloroplastgenomecodonoptimization,chloroplastgenomemodification,explorationofspecies evolution,and increased expression of exogenous genes.Method The chloroplast genome of S.tuberosumvar.cormosusHuaiyushanwassequencedbyhigh-throughputsequencingtechnology.Thestru
10、cture,genecompositionandcodonpreferenceoftheassembledandannotatedchloroplastgenomewereanalyzedusingbioinformaticsanalysissoftware.ResultThechloroplastgenomesizeofS.tuberosumvar.cormosusHuaiyushanwas155296bp,whichwasaclassical4-segmentstructure.Thelengthoflargesinglecopyregion(LSC),smallsinglecopyreg
11、ion(SSC)andinvertedrepeatregion(IR)was85737,18373and25593bprespectively,andtheproportionoftotalguanineandcytosine(GCratio)was37.88%.Atotalof133geneswerereleased,including87CDSgenes,37tRNAgenes,8rRNAgenesand1pseudogene.Atotalof38simplesequencerepeat(SSR)loci(36singlebaserepeatsand2doublebaserepeats)a
12、nd32longrepeatsequences(16forwardrepeatsand16palindromerepeats)weredetectedinthechloroplastgenomeofS.tuberosumvar.cormosusHuaiyushan.ThevariationrangeofnucleotidediversityofchloroplastgenomeofS.tuberosumvar.cormosusHuaiyushanwas00.13927.ThehypervariableregionsweremainlydistributedinLSCandSSCregions.
13、LSC region had the highest mutation rates of trnL-UAA-trnF-GAA,cemA,rps12-exon1-clpP1 andclpP1genes,whileSSCregionhadthehighestmutationratesofrpl32-trnL-UAGandycf1genes.Theaverageeffectivenumberofcodon(ENC)valueof87CDSgenesinthechloroplastgenomeofS.tuberosumvar.cormosusHuaiyushanwas47.29,andtherewer
14、e60geneswithENCvaluelargerthan45,indicatingweakcodonpreference.ThepreferenceforcodonsendingwithAandUinthechloroplastgenomeofS.tuberosumvar.cormosusHuaiyushanwaslargelyaffectedbynaturalselection,andlessaffectedbymutationpressure.CGU,AAA,CUU,GUU,GGA,GUA,GGU,UCA,GCU,andCCUwerethe10bestcodonsinthechloro
15、plastgenomeofS.tuberosumvar.cormosusHuaiyushan.ConclusionS.tuberosumvar.cormosusHuaiyushanhasaclosegeneticrelationshipwithS.tuberosumDesiree.Ch,5fig.3tab.41ref.Key words:Solanum tuberosumvar.cormosusHuaiyushan;chloroplastgenome;sequencecharacteristics;codonpreference;optimalcodons;phylogeneticanalys
16、is怀玉山高山马铃薯 Solanum tuberosumvar.cormosusHuaiyushan,又名麻籽洋芋,茄科Solanaceae 茄属 Solanum1 年生草本植物,主要种植区域为江西省玉山县怀玉乡1。怀玉山高山马铃薯食用、药用皆优,获批为国家地理标志农产品23。已有研究表明:怀玉山高山马铃薯与云南德宏和曲靖以及湖北恩施的高山马铃薯种质存在差异4。但怀玉山高山马铃薯的进化来源尚无相关研究报道。叶绿体是高等植物细胞内一种重要的与光合作用和物质代谢相关的细胞器,叶绿体基因组是一套具有母系遗传特征的独立基因组,是高等植物细胞质基因组的组成成分之一5。与核基因组相比,叶绿体基因组全长序列
17、短、易测序获得、基因直系同源、基因结构稳定、保守性较高、进化速率适中,目前已经广泛应用于植物系统发育分析、物种分类鉴定及分子标记开发等研究中,在物种起源、进化、演变及比较基因组学等研究领域发挥着越来越大的作用6。密码子是核酸和蛋白质之间遗传信息传递的桥梁7,mRNA 上的遗传信息以 tRNA 三重密码子传递。氨基酸一般对应1 的密码子8,这些密码子称为同义密码子9。在自然选择或突变偏好的情况下,基因倾向于使用1 的同义密码子,即同义密码子使用偏好性1012。目前,关于茄属的叶绿体基因组研究已有报道1319,而针对怀玉山高山马铃薯的研究大多集中在基因克隆20、转录组分析3、遗传多样性4、脱毒快繁
18、2、DNA 甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析21等方面,对怀玉山高山马铃薯叶绿体全基因组及其密码子使用偏好性方面的研究还未见系统报道。本研究通过对怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组进行测序和组装,分析基于叶绿体基第 41 卷第 1 期洪森荣等:怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组特征及密码子使用偏好性分析93因组的怀玉山高山马铃薯系统进化、结构解析和密码子偏好性等,为怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组研究和应用提供科学依据,也为进一步研究怀玉山高山马铃薯遗传背景、种质资源保护与开发利用奠定基础。1材料与方法1.1材料由上饶市薯芋类作物种质保存与利用重点实验室提供的怀玉山高山马铃薯试管苗。1.2方法1.2.1D
19、NA 提取和测序选取怀玉山高山马铃薯(MLS)试管苗叶片组织,利用植物基因组 DNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取怀玉山高山马铃薯试管苗 DNA,质量分数为 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的完整性,NanoDrop2000分光光度计(ThermoScientific 公司)检测DNA浓度和纯度,用超声波将 DNA 片段化,然后对片段化的 DNA 进行片段纯化、末端修复、3端加 A、连接测序接头,再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增形成测序文库。建好的文库先进行文库质检,质检合格的文库用 BGISEQ-500 平台进行测序。1.2.2叶绿体全基因组
20、的组装与注释通过 SOAPnuk1.3.0 对 rawdata(测序下机的原始数据)进行数据过滤,去除其中的接头序列及低质量 reads(高通量测序中一个反应获得的测序序列),获得高质量的cleandata(对原始数据进行过滤后并剔除了低质量数据的剩余数据)。采用 Noveplastys 软件组装叶绿体基因组核心模块,以起始组装序列为起点开始组装叶绿体 contigs(很多 reads 根据序列拼接在一起拼出的片段),如果 contigs 未环化,则利用 CAP3 软件连接多个 contigs 为完整叶绿体基因组,并手动调整环状叶绿体基因组起始位置。使用 GeSeq、tRNAscan-SE 对
21、叶绿体基因组进行注释,再经过手工校正后得到最终的基因注释结果。将注释完成的怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组序列提交至美国国家生物信息中心(NCBI),获得登录号:OP589401。使用 OGDRAW 绘制叶绿体基因组图谱。1.2.3叶绿体基因组特征分析通过 JSHYCloud 在线工具集分析并统计叶绿体基因组、大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSC)和反向重复区(IR)的鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比例(GC 比例);使用 MISA 软件进行简单重复序列(SSR)分析,单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最小重复值分别设置为 10、6、5、5、5、5;利用 REPuter 软件进
22、行长重复序列(longrepeat)分析,查找正向重复(F)、反向重复(R)、互补重复(C)、回文重复(P)等 4 种重复类型;通过 PasteurGalaxy在线工具集中的 CodonW 模块分析密码子使用情况,设置输出结果为有效密码子数(ENC)和相对同义密码子使用频率(RSCU),其他参数设为默认值。将怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组序列上传至美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行 BLASTn 比对,选择 highlysimilarsequence(megablast)比较相似性在 95%以上的序列,检索获得怀玉山高山马铃薯的近缘种。利用 Gview、VISTAtools、IRscope
23、 和DNADnaSP6.0 软件绘制怀玉山高山马铃薯及其 10 个近缘种(S.cochoaeNC_062512、多毛番茄 S.habrochaites NC_026879、潘 那 利 番 茄 S.pennellii NC_035742、S.bukasovii MT120867、S.bolivienseNC_062870、S.trisectumNC_062469、S.salamancaeNC_062480、S.clivorumNC_062513、S.mortoniiNC_062426、S.insanumMW384851)的变异圈图、mVIST 结构变异图、IR 结构变异图,计算怀玉山高山马铃薯及
24、其 10 个近缘种的基因组核酸多样性(Pi),参数设置 100bp 滑窗,25bp 的步长,并进行中性绘图分析(GC3-GC12 分析)、ENC-plot 分析、PR2-bias-plot 分析和最优密码子分析;对怀玉山高山马铃薯叶绿体基因的 ENC 进行排序,分别选取两端基因各 5 个,构建高表达基因库(ENC 小)和低表达基因库(ENC 大),并计算两者的 RSCU 差值(RSCU)。筛选 RSCU0.08 的高表达密码子,且将RSCU1.00 的高频率密码子定义为怀玉山高山马铃薯叶绿体基因组的最优密码子;最后利用 mafft7.0 和 fasttree2.1.10 软件分别对怀玉山高山马
25、铃薯和 18 个近缘种以及烟草属 Nicotiana 2 个外类群物种进行序列比对和构建进化树。2结果与分析2.1叶绿体基因组序列特征分析经过测序组装的完整的叶绿体基因组长度为 155296bp,图 1 显示:怀玉山高山马铃薯叶绿体94浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日基因组呈典型的四分体结构,包含 1 个 LSC、1 个 SSC 和 2 个将 LSC 与 SSC 分隔开的 IR(IRa 和 IRb)。基因组的总 GC 比例为 37.88%,A、T、C、G 比例分别为 30.65%、31.47%、19.24%、18.65%。LSC、SSC 和 IR 的长度分别为 85737、183
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