基于UPLC-QTRAP-MS_MS与网络药理学的苍降辟瘟香防治新型冠状病毒肺炎的潜在活性成分研究.pdf
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1、Unive-MS/药理毒理21PharmacyandChineseMateriaMedica2023;14(6)中药与临床基于 UPLC-QTRAP-MS/MS 与网络药理学的苍降辟瘟香防治新型冠状病毒肺炎的潜在活性成分研究梁迪,薛清彩,刘江碧,陈思敏摘要】目的:对苍降辟瘟香四种主要配方成分(苍术、沉香、大叶降真香、龙肝香)防治新型冠状病毒肺炎的潜在活性成分进行鉴别与筛选。方法:应用Thermo Scientific vanquish超高效液相色谱-Thermo ScientificQ-Exactive Orbitrap离子阱质谱联用鉴定苍降辟瘟香燃烧后空气中挥发物的主要化学物质和药材来源,通
2、过TCMSP数据库获取苍降辟瘟香的活性成分与相关靶点;通过Genecards数据库获取COVID-19的相关靶点,String数据库绘制蛋白质相互作用网络(PPI),Cy t o s c a p e 软件构建“化学成分/疾病-药物靶点-基因功能相互关系图”与“化学成分/疾病-药物靶点-代谢通路相互关系图”并使用Centiscape插件筛选核心靶点;David数据库对交集靶点进行GO与KEGG富集分析,Autodock1.5.7软件与Sailvina beta 2.0插件将筛选得到的活性成分与核心靶点进行分子对接验证,Pymol软件将分子对接结果进行可视化分析。结果:苍降辟瘟香燃烧后空气中挥发物
3、共分离出110 7 个不同保留时间的一级质荷比,结合质谱一二级数据库和人工鉴定确认了其中56 种化合物结构,其类别主要为苯丙素、生物碱、黄酮、苷以及类;以OB值30%、DL值0.18 为筛选条件,获得苍降辟瘟香中药物活性成分共2 1个,药物-疾病交集靶点共46 个,核心靶点共10 个;GO与KEGG富集分析预测了37 9个GO功能富集条目与12 4条KEGG代谢通路;分子对接结果证实苍降辟瘟香中主要活性成分与核心靶点具有较为稳定的结合活性。结论:苍降辟瘟香可能通过多成分、多靶点及多通路参与COVID-19的防治。关键词】苍降辟瘟香;苍术;沉香;大叶降真香;龙肝香;UPLC-QTRAP-MS/M
4、S;网络药理学;分子对接中图分类号 R285.5文献标识码 A文章编号 16 7 4-92 6 X(2023)06-005-014Study on the potential active components of CangJiangPiWen incense against COVID-19 based on UPLC-QTRAPMS and network pharmacology/LIANG Di,XUE Qing-cai,LIU Jiang-bi,CHEN Si-min/(School of Pharmacy,Chengdursity of Traditional Chinese M
5、edicine,Chengdu 611137,Sichuan)Abstract Objective:To identify and screen the potential active ingredients of four main ingredients of CangJiangPiWenincense(Cangzhu,Chenxiang,Dayejiangzhenxiang,Longganxiang)for prevention and treatment of COVID-19.Method:Thermo Scientific vanquish-HPLC-Thermo Scienti
6、fic Q-Exactive Orbitrap Ion trap mass spectrometry was used to identifythe main chemical substances and sources of the volatile substances in the air after the burning of CangJiangPiWen incense.The active components and related targets of CangJiangPiWen incense were obtained through TCMSP database.T
7、he relevanttargets of COVID-19 was obtained through the Genecards database.Protein-protein interaction networks(PPIs)was drawnthrough string database.The Chemical Component/Disease-Drug Target-Gene Function Interaction Diagram and ChemicalComponent/Disease-Drug Target-Metabolic Pathway Interaction D
8、iagram were constructed by cytoscape software,and thecentiscape plugin was used to screen core targets.GO and KEGG enrichment analysis on intersecting targets was conductedthrough the David database.Through Auto dock 1.5.7 software and the Sailvina beta 2.0 plug-in,the screened active ingredientswer
9、e verifed by macromolecular docking with the core target.Finally,the results of macromolecular docking were visualized byPymol software.Result:The results showed that a total of 1107 primary mass to charge ratios with different retention times wereseparated from the volatile compounds in the air aft
10、er the combustion of CangJiangPiWen incense.56 compounds were confirmedin their structures by combining mass spectrometry primary and secondary databases and manual identification,with the maincategories being phenylpropanoids,alkaloids,flavonoids,glycosides,and terpenes.Using OB value30%and DL valu
11、e0.18 asscreening conditions,a total of 21 active ingredients,46 drug disease intersection targets,and 10 core targets were obtained fromCangJiangPiWen incense.GO and KEGG enrichment analysis predicted 379 GO functional enrichment entries and 124 KEGGmetabolic pathways.The results of macromolecular
12、docking confirmed that the main active components of CangJiangPiWen基金项目】成都市科技项目(2 0 2 2-YF05-01876-SN作者单位 成都中医药大学药学院,四川成都6 11137作者简介】梁迪,在读硕士研究生,主要从事中药药理学研究Tel:13135362582 Email:通讯作者 陈思敏(197 8-),副教授,主要从事中药药理学研究Email:chensimin 收稿日期 2 0 2 3-0 2-2 7incense had relatively stable binding activity with the
13、 coretarget.Conclusion:CangJiangPiWen incense may participatein the treatment of COVID-19 through multiple components,targets,and pathways.Key words CangJiangPiWen incense;Cangzhu;Chenxiang;Dayejiangzhenxiang;Longganxiang;liquidchromatography-mass spectrometry;network pharmacology;moleculardocking22
14、Pharmacy andhinese Materia Medica2023;14(6)中药与临床2019年12 月湖北省武汉市出现不明原因的肺炎病例,后被证实为新型冠状病毒肺炎(Corona VirusDisease2019,CO VID-19),又称“新冠肺炎”。根据现有病例资料显示,新冠肺炎是一种急性感染性肺炎,流行度极高,通过直接传播、接触传播以及气溶传播等方式作为其主要的传播途径。大部分感染者主要表现为发热、乏力、干咳以及呼吸困难等呼吸道症状,重症患者可能出现急性呼吸综合征、凝血功能障碍、代谢性酸中毒以及多器官功能衰竭等2-1。熏香疗法在我国有着悠久的药用历史。春秋时期,古人就常佩戴香
15、囊以驱除移恶之气14。随着中医的理论体系和治疗手段的不断发展与完善,中医经书上记载了许多关于熏香方剂避邪防瘟的治疗方案,其中包括流行性感冒、支气管哮喘以及气管炎等呼吸系统疾病5。根据熏香疗法的现代研究,主要包括两类:一是通过自然挥发香气(挥发性物质),二是通过燃烧形成香气;相关研究表明,传统香囊配方中的挥发性成分通过呼吸道进入人体,并在口鼻周围形成高浓度的局部消毒环境,对细菌和病毒产生抑制或杀灭作用并调节机体的免疫系统,例如防感冒香袋能够预防流感病毒和呼吸道细菌的感染并促进体内免疫球蛋白的生成,并对于流感、麻疹和流行性脑膜炎有良好的辅助治疗效果;燃熏法主要通过形成药分子膜层,积聚在呼吸道病毒或
16、细菌易侵人的鼻窦腔与咽喉处,阻断了病毒或细菌的传播途径5.7 ,同时,这些燃烧产生的挥发性物质具有抑制或杀灭病毒的能力,例如苍术燃烧时产生挥发性物质-苍术酮对甲型流感病毒H3N2亚型、乙型流感病毒以及高致病性禽流感病毒H5N1亚型株均有杀灭作用;艾叶燃烧产生的气体已被证实对流感病毒、副流感病毒、鼻病毒以及腺病毒具有高效抗病毒作用8-9。新冠肺炎在中医理论上属于“瘟疫”的范畴,其病机特点为:湿、热、毒、瘀,病位在肺,其次为脾胃,并累及肝5。在2 0 0 3年的非典期间,许多医院采用中药的熏香疗法进行防疫,如隶属北京大学的深圳医院采用苍术熏蒸法对医院内进行日常消毒,实现了院内医护人员零感染的成绩0
17、。在现今的新冠肺炎的防治中,熏香疗法也发挥了重要的作用。在2 0 2 0 年武汉市出台的新型冠状病毒感染的肺炎中医药居家预防推荐方案中香薰疗法为三大推荐方案之一,在疫情高发区-湖北黄冈也采用熏香疗法进行防疫,例如黄冈市中医院在新冠肺炎期间采用艾条燃熏方式对医院内进行日常消毒,同样也实现了院内医护人员零感染的成绩。苍降辟瘟香采用苍术、沉香、大叶降真香、龙肝香等多种预防和治疗传染性疾病的中药成分所制成,其燃熏后产生的挥发性成分大部分具有宣散肺气、开通经等功效,后经口鼻、皮肤以及经络吸收后可作用于全身,从而达到驱邪、祛病以及强身等作用5-6 。UPLC-QTRAP-MS/MS(超高效液相三重四级杆线
18、型离子阱串联质谱)能够同时测定多种成分,且分析时间短、灵敏度高以及专属性强,是可靠的中药材内在质量综合评价的检测方法12 。网络药理学采用虚拟计算机方法对整个生物系统进行可视化分析并有效预测相关靶点和通路,而分子对接基于受体结构的虚拟筛选方法,针对性的预测了配体蛋白与受体基因之间潜在的药物亲和力类型以及结合方式,是筛选或设计药物的一项重要的计算机辅助技术。本研究通过采用UPLC-QTRAP-MS/MS技术对苍降辟瘟香燃烧的挥发物进行了成分鉴定,并对应了每种鉴定物的配方来源(苍术、沉香、大叶降真香、龙肝香);通过网络药理学初步预测了苍降辟瘟香主要的活性成分、作用靶点及信号通路,并通过分子对接技术
19、预测苍降辟瘟香与核心靶点的可能作用机制,为苍降辟瘟香在新冠肺炎的临床应用中提供理论基础。1材料与方法1.1试剂与仪器苍降辟瘟香购自珠海临湾堂科技有限公司生产,批号2 0 2 2 110 7。经成都中医药大学药用植物教研室马云桐研究员鉴定苍术为茅苍术Atractylodeslancea(T h u n b.)D C的干燥根茎;沉香为白木香Aquilaria sinensis(L o u r.)G i l g 含有树脂的木材;大叶降真香为两粤黄檀DalbergiaBenthamii含有树脂的木材;龙肝香为滇黔黄檀DalbergiayunnanensisFranch 含有树脂的木材。Thermo S
20、cientific Vanquish超高效液相色谱仪,ThermoScientificQ-ExactiveOr-bitrap四极杆轨道阱高分辨质谱仪。色谱质谱接口为Thermo Scientific H-ESI。1.2样品处理取线香于洁净通风橱里燃烧,在其上方5cm悬挂开口向下的洁净EP管,待燃烧5分钟后,取下EP管,称重,加入EP管增重重量的50 倍体积的甲醇,涡旋振荡5分钟,16 50 0 rpm高速离心10 min,分取上清,用于进样分析。各药材粉碎过10 0 目,23Pharmacy and Clinics f Chinese Materia Medica2023;14(6)中药与临床
21、称取约50 mg,置EP管中,加入甲醇5mL,超声提取30 min,静置10 min,取上清16 50 0 rpm高速离心10min,分取上清,用于进样分析。1.3QTRAP高分辨质谱和化合物结构鉴定色谱条件:采用色谱柱(WatersAcquityUPLCC18,1.7 m);流动相为乙腈(A)和超纯水(B),通过二元线性梯度洗脱,流动相梯度:0 45min(5%90%A),流速:0.4mLmin;进样量:1 L;柱温:35-40 C。质谱条件:lon SourceType:H-ESI;Sp r a y Vo l t-age:Static;Positive lon(V):3500;Negati
22、ve lon(V):3500;Sheath Gas(Arb):35;Aux Gas(Arb):15;Sweep Gas(Arb):l;lon Transfer Tube Temp(C):350;Va p o r i z e r T e mp(C):350;扫描模式:FullMS/dd-MS2,正负离子同时扫描;一级分辨率:7 0 0 0 0;二级分辨率:17 50 0;扫描范围:m/z80150 0;碰撞能量梯度:2 0,40,6 0 eV。分子结构鉴定:化合物检索软件为compounddiscoverer3.2,二级碎片库采用本地mzvault数据库和在线的二级库mzcloud相结合的方式进
23、行。程序鉴定完成后,对相应结果进行人工鉴定核对,主要采用 Pubchem(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)相应物质UPLC-ESI-QTRAP下的二级裂解规律为主要参考。1.4苍降辟瘟香化学成分的筛选将1.3部分所鉴定的苍降辟瘟香的化学成分导人到TCMSP数据库(中药系统数据库及分析平台,https:/ targets(对应的靶蛋白)、OB值(口服生物利用度,oralbioavailability)以及DL值(类药性,drug-likeproperties)的参数,并按照OB值30%;DL值0.18 的参数条件对化学成分进行筛选,最后将得到的化学成分进行归纳。
24、将已筛选的化学成分的对应靶蛋白在Uniprot数据库(蛋白质数据库,https:/www.uniprot.org/)导人,得到对应靶蛋白的标准基因名称。1.5COVID-19疾病靶点的预测以检索词COVID-19在GeneCards数据库(疾病靶点预测数据库,www.genecards.org)进行检索,得到对应的靶蛋白基因。将上述与1.4部分得到的靶蛋白基因导人到Venny 2.1网站(https:/b.csic.es/tools/venny/),并绘制苍降辟瘟香与COVID-19的交集靶点。1.6PPI网络的建立将1.5部分得到的药物-疾病的交集靶点导人到String数据库(蛋白互作关系数
25、据库,https:/cn.string-db.org/),在最低相关度得分的选项中选择0.40 0,其他设置默认,然后进行PPI(蛋白质一蛋白质相互作用网,protein-proteininteractionnetworks)分析。1.7GO与KEGG富集分析与核心基因的筛选将1.5部分得到的药物-疾病的交集靶点导人到Davids数据库(基因功能与通路富集分析数据库,https:/david.ncifcrf.gov/)进行GO(基因本体,geneontology)与KEGG(京都基因与基因组百科全书,kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析,并通
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