禾谷镰刀菌Fgβ2 S138A对多菌灵和噻菌灵敏感性的影响.pdf
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1、40(1)206-218 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 2 月 收稿日期:2023-05-09 基金项目:国家自然科学基金(31871916);国家重点研发项目(2022YFD1400104)作者简介:蒋凡,女,硕士研究生,E-mail:;*通信作者,博士,教授,E-mail:jghuang 。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.072 禾谷镰刀菌Fg 2 S138A对多菌灵和噻菌灵敏感性的影响 蒋 凡1,吕俊博1,赵彦翔1,张迎新2,黄金光1*(1.青岛农业大学植物医学学院/山东省高
2、校植物病虫害绿色防控工程研究中心,青岛 266109;2.青州市农业技术推广中心,青州 262500)摘要:由禾谷镰刀菌 Fusarium graminearum 引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是小麦、大麦、燕麦、黑麦等禾谷类作物的毁灭性病害。目前,生产上防治小麦赤霉病主要依靠化学药剂防治,多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂使用较为广泛,其作用靶标为 微管蛋白。禾谷镰刀菌有 2 个 微管蛋白,通过分子对接结果发现 2 微管蛋白第 138 位氨基酸位点可能为多菌灵结合位点。本研究对 2 第 138 位丝氨酸位点进行突变研究,以明晰其生物学功能。结果表明 Fg2 S13
3、8A 突变后禾谷镰刀菌对多菌灵的敏感性显著增加,EC50值由 0.617 mg/L 降至 0.290 mg/L,但不影响对噻菌灵的敏感性,EC50值为 0.950 mg/L 左右,并且该突变不影响禾谷镰刀菌菌丝营养生长、无性繁殖、有性生殖和致病性。本研究结果可为多菌灵对小麦赤霉病的化学防治提供理论基础,在生产上具有一定指导意义。关 键 词:禾谷镰刀菌;小麦赤霉病;药剂敏感性;定点突变 中图分类号:S432.1 文献标识码:A 文章编号:1005-9261(2024)01-0206-13 Fg2 S138A Affects the Sensitivity of Fusarium graminea
4、rum to Carbendazim and Thiabendazole JIANG Fan1,L Junbo1,ZHAO Yanxiang1,ZHANG Yingxin2,HUANG Jinguang1*(1.College of Plant Health and Medicine,Qingdao Agricultural University/Shandong Engineering Research Center for Environment-Friendly Agricultural Pest Management,Qingdao 266109,China;2.Qingzhou Ag
5、ricultural Technology Promotion Center,Qingzhou 262500,China)Abstract:Fusarium head blight(FHB)caused by Fusarium graminearum is a devastating disease of wheat,barley,oats,rye,and other cereal crops.Currently,the control of FHB in production mainly depends on chemical agents,among which carbendazim
6、and other benzimidazole fungicides are widely used.The target of these fungicides is-tubulin.There are two tubulins in F.graminearum.A previous study showed that the 138th amino acid of 2-tubulin might be a carbendazim binding site.In this study,a Fg2 Ser138 mutation was constructed to clarify its b
7、iological function.The results showed that the sensitivity of Fg2 S138A mutation to carbendazim was significantly increased,and the EC50 value decreased from 0.617 mg/L to about 0.290 mg/L,however,the mutations did not affect the sensitivity to thiabendazole,and the EC50 value was about 0.950 mg/L,a
8、nd all of them did not affect the vegetative growth,asexual reproduction,sexual reproduction and pathogenicity of F.graminearum.These results provide a theoretical basis for the chemical control of carbendazim against FHB and have a particular guiding significance in production.Key words:Fusarium gr
9、aminearum;Fusarium head blight;fungicide sensitivity;site-directed mutagenesis 第 1 期 蒋凡等:禾谷镰刀菌 Fg2 S138A 对多菌灵和噻菌灵敏感性的影响 207 小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是小麦的主要病害,该病的主要病原菌是禾谷镰刀菌 Fusarium graminearum。除此之外,燕麦镰刀菌 F.auenaceum、黄色镰刀菌 F.culmorum 等镰刀菌属真菌也能引起小麦赤霉病。小麦赤霉病可降低作物产量,影响品质,限制现代农业的可持续发展1,2。近年来,受气候变化
10、、耕作方式变化等因素影响,小麦赤霉病在我国小麦主产区流行频率显著升高3。禾谷镰刀菌侵染和定殖小麦后,会影响小麦籽粒发育并且产生真菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)等,使其不适合作为食品和饲料使用4,影响经济效益,也对人畜健康造成严重威胁5。目前,已经开发了多种策略来控制该病害,包括农艺措施、抗病品种的利用、生物防治和杀菌剂的使用等。近年来,关于小麦赤霉病的生物防治已有很多研究。徐剑宏等6分离到的枯草芽胞杆菌,能较好地抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长和孢子的萌发,田间条件下对小麦赤霉病的防治效果能达 40.37%。何艺琴等7
11、分离到的枯草芽胞杆菌 XG-7,在实验室条件下对小麦赤霉病菌有较好的抑制效果。Sun 等8分离的解淀粉芽胞杆菌 ES-2p5,能通过分泌 fengycin 和 surfactin 等活性物质抑制禾谷镰刀菌的生长。徐丽梅等9筛选到解淀粉芽胞杆菌 AX-3,在实验室条件下可抑制禾谷镰刀菌的生长。化学防治目前仍是控制小麦赤霉病的主要方法10,11。在我国,多菌灵(Carbendazim,MBC)等苯并咪唑类杀菌剂已被广泛用于防治该病害12。然而由于多菌灵作用位点单一,长期大量使用致使病原真菌对其产生抗药性,导致近年来多菌灵的防效逐渐降低13。因此,研究小麦赤霉病菌抗药性机制,依据靶标蛋白结构改造传统
12、杀菌剂,指导农业生产科学合理用药具有重要的生产意义。研究表明,苯并咪唑类杀菌剂的作用机制是与病原菌的 微管蛋白结合,阻止其与 微管蛋白组装微管或使已组装的微管解聚,使纺锤体不能形成,阻止真菌细胞的有丝分裂10。病原菌对苯并咪唑类杀菌剂产生抗性的主要机制是 微管蛋白氨基酸的点突变2,13,14,其中最常见和抗药性相关的突变发生在第 198位和第 200 位,特别是第 198 位的谷氨酸被丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸取代,第 200 位的苯丙氨酸被酪氨酸取代15,16。近期有研究者发现在单囊壳白粉病菌 Podosphaera xanthii 中 微管蛋白的 Ser138 可能参与同MBC 的结合,从而使
13、 微管蛋白的构象发生变化,且该位点的突变会影响 MBC 与 微管蛋白的相互作用17。由此,推测该突变可能引起病原菌药剂敏感性的变化,为了明确禾谷镰刀菌中 Ser138 位点突变对禾谷镰刀菌对包括多菌灵在内的苯丙咪唑类杀菌剂敏感性的影响,本文通过定点突变构建了 S138A 突变菌株,并对突变体菌株与野生型菌株在菌丝形态及生长速率、产孢量、有性生殖等表型以及对多菌灵和噻菌灵的敏感性进行了比较,为研究二者互作机理和抗药性机制奠定基础。1 材料与方法 1.1 材料 菌株和试剂:禾谷镰刀菌野生型菌株 PH-1 由实验室长期保存,禾谷镰刀菌 Fg2 微管蛋白基因敲除体菌株 Fg2、互补菌株 ComFg2
14、及 138 位氨基酸突变菌株 Fg2 S138A 在本研究中获得;大肠杆菌(DH5)于实验室长期保存、质粒 pKN 由实验室长期保存;DNA 胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司,Taq DNA 聚合酶和限制性内切酶购于宝日医生物科技有限公司。98.5%多菌灵和98%噻菌灵原药由青岛中达农业科技有限公司提供。本研究中的所有引物由上海生工生物工程有限公司合成(表 1)。培养条件:所有禾谷镰刀菌菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar,PDA)培养基上于 25 培养箱中培养,用于后续试验。羧甲基纤维素(Carboxymethylcellulose,
15、CMC)培养基用于诱导分生孢子的产生;胡萝卜培养基用于有性生殖的培养。培养基:PDA 培养基:去皮马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂糖 15 g、蒸馏水 1 L,高温灭菌;CMC培养基:羧甲基纤维素钠 15 g、硝酸钠 2 g、硫酸镁 0.5 g、磷酸二氢钾 1 g、酵母提取物 1 g、蒸馏水 1 L,高温灭菌;LB 培养基:胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化钠 10 g、蒸馏水 1 L(固体 LB 培养基加 15 g/L 琼脂粉),高温灭菌;胡萝卜培养基:胡萝卜 200 g、琼脂粉 9 g、蒸馏水 1 L,高温灭菌;TB3 培养基:酵母提取物 3 g、酪蛋氨基酸 3 g、蔗
16、糖 200 g、蒸馏水 1 L,高温灭菌(固体培养基加入 9 g/L 琼脂粉)。208 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 表 1 本研究所用引物 Table 1 Primers used in this study 引物 Primer 序列 Sequence(5-3)1F GATGAAGCCACTCTCACCCC 2R ttgacctccactagctccagccaagccTGGGTCTGGTCGTTTCACTG 5F gaatagagtagatgccgaccgcgggttTGTTTCTCATCCCCTTCTTCG 6R TCTTTCTCGTTATCTGACTTTTGC 11F G
17、GCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA HY-F GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA HY-R GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA YG-F GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT YG-R AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC 12R AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC 3F GGCGAACCCACCACCAAAA 4R CGATGTCGGCGTCTTGGTAT 7F TTTGGGGTTTGCTTTTGGG 8R TGTCTTTGTGCTCGGCTTTTA 9F CGTTTTCAATAG
18、TTTCCTCGGTC 10R TGCGTGCGGCTACGATTTA ComFg2-F CTAGCTAGCGGTGGCTTGCTGACTAAGGATT ComFg2-R CCGCTCGAGCACTGGCTTTGCGAAGATGTA M13-48 GAGCGGATAACAATTTCACAC S138A-F TCCAGCTGACGCACGCCCTCGGCGGT S138A-R GGCGTGCGTCAGCTGGAAACCCTGAA M13R GGAAACAGCTATGACCATGA 注:2R 引物和 5F 引物中用于重叠延伸的序列以小写字母显示并用下划线指示;Nhe 的酶切识别位点(GCTAGC)
19、和 Xho 的酶切识别位点(CTCGAG)以粗体显示。Note:Sequences used for overlap-extension in primer 2R and primer 5F are in lower case and underlined.The restriction sites of Nhe (GCTAGC)and Xho (CTCGAG)are in bold.1.2 方法 1.2.1 Fg2 敲除突变体的获得 利用 Split-marker PCR 技术18通过多轮 PCR 将 Fg2 基因的侧翼序列(UP/DOWN)分别与潮霉素抗性基因 HYG 的两部分(HY/YG
20、)融合,利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化的方法19将 UP-HY 和 YG-DOWN 融合片段转化至禾谷镰刀菌野生型菌株 PH-1的原生质体中,然后在含有潮霉素的 TB3 固体培养基上筛选转化子。通过 PCR 对获得的转化子进行验证,提取转化子 DNA,利用引物 3F/4R 验证基因组中是否还存在目的基因,利用引物 7F/12R 和 11F/8R 分别用于验证融合片段是否在正确的位置发生了同源重组(图 1)。为确认得到的转化子进行了正确的基因置换且未发生易位插入,对 PCR 验证正确的转化子进行 Southern Blot 验证。使用限制性内切酶
21、 Nco 酶切基因组 DNA,以引物 9F/10R 制备探针(图 1),探针的标记与检测按照 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 试剂盒说明书进行。1.2.2 回补载体构建及回补转化 以禾谷镰刀菌 PH-1 基因组 DNA 为模板,以 ComFg2-F/ComFg2-R 为引物扩增回补片段,与 Nhe 和 Xho 酶切后的 pKN 连接,构建回补载体 pKN-ComFg2。通过 PEG 介导的原生质体转化的方法19将回补载体 pKN-ComFg2 转化入敲除体菌株 Fg2 中,通过潮霉素和 G418筛选转化子,提取回
22、补转化子 DNA,利用引物 ComFg2-F 和 M13-48 进行 PCR 验证,验证正确的作为回补菌株 ComFg2。第 1 期 蒋凡等:禾谷镰刀菌 Fg2 S138A 对多菌灵和噻菌灵敏感性的影响 209 7F UP Fg2HYYGHYG9F 10R11F12R1F2R3F4R5F6R 8RDOWN 图 1 构建基因敲除体的引物示意图 Fig.1 Schematic drawing of the primers used to generate the gene replacement construct 1.2.3 Fg2 S138A 突变载体的构建 以测序正确的回补载体 pKN-Co
23、mFg2 为模板,以 S138A-F/S138A-R为引物进行扩增并回收,向上述 PCR 产物中加入 1 L Dpn 酶于 37 水浴锅中孵育 1 h,然后将酶解产物热激转化至大肠杆菌 DH5 感受态细胞中,在含有氨苄青霉素的 LB 固体培养基上培养过夜。对长出的单克隆使用引物 S138A-F/M13R 进行菌液 PCR 验证,挑选两个验证正确的单克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序确认。使用 PEG 介导的原生质体转化法19将测序确认正确的质粒转入敲除体菌株 Fg2 的原生质体中,方法步骤与 1.2.2 中制备 Fg2 基因的回补体相同。1.2.4 禾谷镰刀菌菌株的生长发育表型分析(1)菌
24、落形态观察及生长速率测定:从活化 4 d 的野生型菌株、突变体菌株和回补菌株菌落边缘打取相同直径大小的菌饼接种到培养平板中央,于 25 恒温培养箱中培养 4 d,每隔 24 h 观察菌落以及菌丝形态,并采用十字交叉法测量菌落直径,96 h 时拍照记录。每个处理设 3 个平板重复。(2)分生孢子产孢量测定:从活化 4 d 的野生型菌株、突变体菌株和回补菌株菌落边缘打取相同直径大小的菌饼分别接种至 100 mL 同一批次 CMC 液体培养基中,25、200 r/min 摇培 5 d。用四层纱布过滤菌丝,4000 r/min 离心 5 min,弃上清;然后用 20 mL 无菌水重悬孢子,置于显微镜下
25、用血球计数板计数,每个菌株样品数 3 个视野,取平均值。每个菌株设置 3 个重复。(3)有性世代测定:从活化 4 d 的野生型菌株、突变体菌株和回补菌株菌落边缘打取相同直径大小的菌饼接种至胡萝卜培养基上,于 25 恒温培养箱中培养至菌丝长满平板,刮掉表面气生菌丝,加入 1 mL 2.5%吐温-60 涂布均匀,待培养基表面晾干封口。然后放在 25 黑光灯下 12 h 光照/12 h 黑暗交替条件下继续诱导培养,当新长出来气生菌丝时再加入 2.5%吐温-60 并压平,重复 34 次。在显微镜下观察子囊壳及子囊、子囊孢子形成状况并拍照。每个菌株设置 3 个重复。1.2.5 致病力测定 (1)小麦胚芽
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