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不同浓度伏立康唑对人急性单核细胞白血病细胞株来源巨噬细胞免疫功能的影响.pdf
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1、论著不同浓度伏立康唑对人急性单核细胞白血病细胞株来源巨噬细胞免疫功能的影响滕国杰 聂秀红(首都医科大学宣武医院呼吸与危重症医学科,北京 1 0 0 0 5 3)【摘要】目的 探讨不同伏立康唑药物浓度对人急性单核细胞白血病细胞株(h u m a n a c u t e m o n o c y t i c l e u k e m i a c e l l l i n e,THP-1细胞株)来源巨噬细胞免疫功能的影响。方法 TH P-1来源巨噬细胞中加入最终浓度为0、0.2 5、0.5、1、2、4、8、1 6、3 2、6 4 g/m L的伏立康唑,加入灭活烟曲霉菌液(i n a c t i v a t
2、 e d A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s l i q u i d,I A F L),培养箱孵育6 h。检测培养上清液中肿瘤坏死因子-(t u m o r n e c r o s i s f a c t o r-,TN F-)、白细胞介素-1(i n t e r l e u k i n-1,I L-1)及白细胞介素-1 0(i n-t e r l e u k i n-1 0,I L-1 0)的浓度;流式细胞仪检测THP-1来源巨噬细胞膜表面T o l l样受体-2(T o l l l i k e r e c e p t o r-2,T L R 2)
3、、T o l l样受体-4(T o l l l i k e r e c e p t o r-4,T L R 4)、树突状细胞相关C型凝集素-1(d e n d r i t i c c e l l-a s s o c i a t e d C-t y p e l e c t i n-1,D e c t i n-1)的表达。结果 加入浓度46 4 g/m L伏立康唑时,培养上清液中TN F-、I L-1的浓度较对照组(仅含TH P-1来源巨噬细胞和灭活烟曲霉菌液)明显升高(P均0.0 5)。加入浓度16 4 g/m L伏立康唑时,巨噬细胞膜表面T L R 2、T L R 4、D e c t i n-
4、1平均荧光强度(m e d i a n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y,MF I)较灭活烟曲霉菌液对照组均明显升高(P0.0 5)。在伏立康唑浓度为4 g/m L、4 g/m L、1 g/m L时,细胞膜表面T L R 2、T L R 4、D e c t i n-1的平均荧光强度分别达到峰值。结论 在灭活烟曲霉菌液存在时,伏立康唑浓度在46 4 g/m L时可以刺激TH P-1来源巨噬细胞TN F-、I L-1分泌明显增加,细胞膜表面T L R 2、T L R 4和D e c t i n-1的表达增强。但这种加强并不是随伏立康唑剂量增加而持续
5、增高。【关键词】伏立康唑;巨噬细胞;模式识别受体;细胞因子【中图分类号】R 9 7 8.5 【文献标志码】A 【文章编号】1 6 7 3-3 8 2 7(2 0 2 3)1 8-0 3 8 5-0 6E f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f v o r i c o n a z o l e o n T H P-1-i n d u c e d m a c r o p h a g e i mm u n e f u n c t i o nT E NG G u o j i e,N I E X i u h o n
6、 g(D e p a r t m e n t o f r e s p i r a t o r y a n d c r i t i c a l c a r e m e d i c i n e,X u a n w u H o s p i t a l C a p i t a l M e d i c a l U n i v e r s i t y,B e i j i n g 1 0 0 0 5 3,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o e x p l o r e
7、t h e e f f e c t s o f c o n c e n t r a t i o n s o f v o r i c o n a z o l e o n t h e m a c r o p h a g e s i mm u n e f u n c t i o n i n d u c e d b y THP-1 c e l l s.M e t h o d s D i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f v o r i c o n a z o l e w e r e a d d e d t o TH P-1 i n d u c
8、e d m a c r o p h a g e s,t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f v o r i c o n a z o l e w a s 0,0.2 5,0.5,1,2,4,8,1 6,3 2,6 4 g/m L,a n d t h e i n a c t i v a t e d A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s l i q u i d(I A F L)w a s a d d e d,i n c u b a t e f o r 6 h o u r s.T u m o r n e c
9、r o s i s f a c t o r-(T N F-),i n t e r l e u k i n-1(I L-1),a n d i n t e r l e u k i n-1 0(I L-1 0)c o n c e n t r a t i o n i n t h e c u l t u r e s u p e r n a t a n t w e r e d e t e c t e d.F l o w c y t o m e t r y w a s u s e d t o d e-t e c t t h e e x p r e s s i o n o f T o l l l i k e
10、r e c e p t o r-2(T L R 2),T o l l l i k e r e c e p t o r-4(T L R 4),a n d d e n d r i t i c c e l l-a s s o c i a t e d C-t y p e l e c t i n-1(D e c t i n-1)o n t h e m a c r o p h a g e s m e m b r a n e s u r f a c e.R e s u l t W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f v o r i c o n a z o l
11、e w a s b e t w e e n 4 a n d 6 4 g/m L,t h e c o n c e n t r a t i o n s o f TN F-a n d I L-1 w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o f t h e c o n t r o l g r o u p(c o n t a i n i n g o n l y THP-1-d e r i v e d m a c r o p h a g e s a n d i n a c t i v a t e d A s p e r
12、 g i l l u s f u m i g a t u s l i q u i d)(P0.0 5).W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f v o r i c o n-a z o l e w a s 1-6 4 g/m L,t h e m e d i a n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f T L R 2,T L R 4,a n d D e c t i n-1 o n t h e c e l l m e m b r a n e s u r f a c e w a s作者简介:滕国杰,
13、女(汉族),博士,副主任医师.E-m a i l:t e n g 1 9 9 71 6 3.c o m通信作者:聂秀红,E-m a i l:n i e x i u h o n g 2 0 1 91 6 3.c o m583 中国真菌学杂志 2 0 2 3年1 0月 第1 8卷 第5期 C h i n J M y c o l,O c t o b e r 2 0 2 3,V o l 1 8,N o.5 s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f t h e I A F L c o n t r o l g r o u p(P0.
14、0 5).Wh e n v o r i c o n a z o l e c o n c e n t r a t i o n w a s 4 g/m L,4 g/m L a n d 1 g/m L,t h e a v e r a g e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f T L R 2,T L R 4 a n d D e c t i n-1 o n t h e c e l l m e m b r a n e s u r f a c e r e a c h e d t h e p e a k.C o n c l u s i o n I n
15、t h e p r e s e n c e o f I A F L,t h e s e c r e t i o n o f T N F-a n d I L-1 f r o m m a c r o p h a g e s i n d u c e d b y THP-1 c o u l d b e s t i m u l a t e d b y v o r i c o n a z o l e.T h e e x p r e s s i o n o f T L R 2,T L R 4 a n d d e c t i n-1 o n t h e s u r f a c e o f m a c r o
16、p h a g e m e m b r a n e w a s e n-h a n c e d.H o w e v e r,t h e e n h a n c e m e n t d i d n o t i n c r e a s e c o n t i n u o u s l y w i t h t h e i n c r e a s e o f v o r i c o n a z o l e d o s e.【K e y w o r d s】v o r i c o n a z o l e;m a c r o p h a g e s;p a t t e r n r e c o g n i t
17、 i o n r e c e p t o r s;c y t o k i n e sC h i n J M y c o l,2 0 2 3,1 8(5):3 8 5-3 9 0 既往研究表明,多种抗真菌药物除了对真菌的杀灭作用外,还具有免疫调节作用,其可能通过宿主免疫细胞信号通路,调节炎症反应,影响免疫细胞对真菌的作用。两性霉素B可以促进炎性细胞因子释放1,而氟康唑可以减少曲霉菌丝刺激后人全血I L-6、I L-8和T N F-的释放2。伏立康唑作为三唑类抗真菌药物,也具有免疫调节作用。S i m-i t s o p o u l o u等3的研究显示伏立康唑通过T L R 2的上调来增强吞噬细
18、胞的促炎程序,F i d a n等4发现,伏立康唑作用下,白念珠菌刺激的外周血单个核细胞的I L-2、干扰素(i n t e r f e r o n,I F N-)和I L-6水平显著增加。在伏立康唑作用下,烟曲霉诱导TH P-1细胞更加显著的炎症基因表达,包括干扰素-和T N F-等基因的表达明显增强,释放T N F-、I L-1明显增加5。伏立康唑浓度差异是否会对免疫状况存在不同影响,目前国内外文献鲜有报道。为此,本研究观察TH P-1来源巨噬细胞加入不同浓度伏立康唑及灭活烟曲霉菌液,检测细胞培养上清液中T N F-、I L-1、I L-1 0分泌水平及细胞膜表面模式识别受体T L R 2
19、、T L R 4、D e c t i n-1表达的变化,探讨伏立康唑药物浓度对巨噬细胞免疫功能的影响差异。1 材料与方法1.1 材料细胞及试剂 人急性单核细胞白血病细胞株(h u m a n a c u t e m o n o c y t i c l e u k e m i a c e l l l i n e,TH P-1细胞株)来源于中科院细胞库,R PM I 1 6 4 0培养基(美国G i b c o-I n v i t r o g e n 公司),胎牛血清(f e t a l b o v i n e s e r u m,F B S)(美 国G i b c o-I n v i t r o
20、 g e n 公司),青霉素-链霉素-二抗溶液(美国G i b c o-I n v i t r o-g e n 公司),肉豆蔻酸佛波醇乙酸酯(p h o r b o l-1 2-m y r i s t a t e-1 3-a c e t a t e,PMA)(中国碧云天试剂公司),伏立康唑(美国辉瑞公司生产),二甲基亚砜(d i m e t h y l s u l f o x i d e,DM S O)(美国S i g m a公司)。烟曲霉菌液的制备 烟曲霉感染患者的分离株,接种在沙堡弱葡萄糖琼脂培养基上于3 7 和5%C O2培养箱下培养5 d,以形成分生孢子。分生孢子通过7 0 n m细胞
21、筛进行过滤,使用R PM I 1 6 4 0重悬分生孢子,在3 7 和5%C O2的完全培养基中进行孵育,1 2 h部分分生孢子形成菌丝,进行收集,将孵育后的烟曲霉分生孢子和菌丝形成的菌液在玻璃管中于1 2 0 高压灭活3 0 m i n6-7。伏立康唑药液配置 伏立康唑粉剂微量电子天平称取1 0 m g,无菌操作下溶解于二甲基亚砜,国外文献报道二甲基亚砜对细胞无明显毒性作用8,加入无内毒素蒸馏水补足至1 m L,进行分装,使用时加入完全培养基,倍比稀释至所需浓度。1.2 方法TH P-1来源的细胞诱导为巨噬细胞 文献报道,TH P-1细胞使用1 0 0 n g/m L佛波酯(PMA)诱导4
22、8 h分化为巨噬细胞9,具有与人外周血单核细胞来源巨噬细胞类似的功能1 0。受不同微环境的影响,使用PMA诱导TH P-1细胞为巨噬细胞,该细胞可以向M 1表型进一步分化,也可以向M 2表型进一步分化1 1。用1 0 0 n g/m L PMA在3 7 诱导TH P-1细胞4 8 h,倒置显微镜动态观察细胞变化。培养4 8 h后显微镜下观察细胞形态改变,细胞由悬浮细胞改为贴壁、并出现聚集、伪足伸出。诱导TH P-1细 胞 形 成 巨 噬 细 胞。将 细 胞 加 入0.0 2%乙二胺四乙酸溶液,使细胞脱离贴壁,离心收集。C C K-8法检测不同浓度伏立康唑联合灭活的烟曲霉 菌 液 对TH P-1
23、来 源 巨 噬 细 胞 的 毒 性 TH P-1细胞诱导形成的巨噬细胞,以每孔1 0 0 L培养液中包含51 03个细胞的浓度,接种于9 6孔培养板。每个孔加入浓度分别为0.2 5、0.5、1、2、4、8、1 6、3 2、6 4 g/m L的伏立康唑后,再加入浓度为51 02个/m L的灭活烟曲霉液,并且设置仅含有TH P-1来源巨噬细胞和灭活烟曲霉菌液的对照683 中国真菌学杂志 2 0 2 3年1 0月 第1 8卷 第5期 C h i n J M y c o l,O c t o b e r 2 0 2 3,V o l 1 8,N o.5 孔。分别3 7、5%C O2培养箱中孵育6、1 2、
24、2 4 h。之后每孔加入1 0 L的C C K-8溶液培养2 h后,用酶标仪在4 5 0 n m处测量吸光度值。实验重复3次,取平均值。不同浓度伏立康唑联合灭活烟曲霉菌液体外刺激TH P-1来源巨噬细胞 每孔1 m L培养基中包含11 06个TH P-1细胞形成的巨噬细胞,接种于2个6孔培养板。孵育过夜。在培养板中,第1孔作为空白孔,其余各孔中加入终浓度为1 05个/m L的灭活烟曲霉菌液之后,再加入浓度分别为0、0.2 5、0.5、1、2、4、8、1 6、3 2、6 4 g/m L的伏立康唑。并且设置仅含有TH P-1来源巨噬细胞和灭活烟曲霉菌液的对照孔,在3 7 和5%C O2培养箱孵育6
25、 h1 2。培养后,收集培养板中每孔的上清液测定培养上清液中的细胞因子T N F-、I L-1、I L-1 0的水平。收获贴壁的巨噬细胞,流式细胞仪检测细胞表面的T L R 2、T L R 4、D e c t i n-1表达。实验重复3次,取平均值。流式 细 胞 检 测 体 外 培 养 细 胞 表 面T L R 2、T L R 4、D e c t i n-1表达 流式管中加入荧光标记抗体:B D P h a r m i n g e nTM P E M o u s e A n t i-H u m a n C D 3 6 9(C l e c 7 A)(D e c t i n-1),B D H o
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